姐妹染色單體差別染色

姐妹染色單體區(qū)分染色法(Sister chromatid differentiation，SCD）是70年代中期發(fā)展起來的染色體處理技術。Latt（1973）在培養(yǎng)的細胞中加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU），當用Hoechst33258 熒光染料染色時，發(fā)現(xiàn)了姊妹染色單體的色差反映和它們之間互換的現(xiàn)象。1974年KO Renberg和Froeed-Lender改進了這一技術，建立了較簡易的BrdU-Giemsa技術。這種技術用于研究細胞周期、染色體半保留復制、染色體的分子結構和畸變，以及DNA的復制、損傷與修復等一系列重要理論問題，還可以用于分析姊妹染色單體互換（Sister chromatid exchange, SCE）頻率。由于SCE能靈敏地檢測染色體的變化，表現(xiàn)出劑量-效應關系。因此，目前已把SCE列為檢測致突變物、致癌物地常規(guī)指標之一。
一、原理
5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxy-urdine, BrdU）在DNA的復制過程中，摻入新合成的鏈并占有胸腺嘧啶（thymidine, T）的位置。根據DNA的半保留復制規(guī)律，哺乳動物或人的細胞在BrdU的培養(yǎng)液中經歷了兩個周期后，它的兩條姊妹染色單體的DNA雙鏈在化學組成上有了差別。當染色體的DNA鏈的兩條多核苷酸鏈都被BrdU所替換，Giemsa染色顯示淺色，如果染色體的DNA鏈中僅有一條多核苷酸鏈被BrdU所替換，Giemsa染色顯示深色。應用姊妹染色單體區(qū)分染色法（SCD）研究來自一個染色體的兩條單體之間在同一個位點發(fā)生同源片段的交換，稱為姊妹染色單體互換。
二、用品和試劑
45℃水浴，紫外線燈（20W）。余同外周血染色體制備。
試劑： BrdU溶液：用無菌青霉素瓶，在普通條件下稱取BrdU 2mg，然后在無菌室內加入無菌生理鹽水4ml，用黑紙避光，4℃冰箱保存，新鮮配置。1×SSC溶液：0.15mol/L NaCl，0.015mol/L 檸檬酸鈉。
三、操作步驟
l．細胞培養(yǎng)：常規(guī)培養(yǎng)人外周血淋巴細胞，24h后，加入BrdU使其終濃度為20μg/ml。
2．繼續(xù)避光培養(yǎng)48小時，終止培養(yǎng)前2—3小時加秋水仙堿。
3．培養(yǎng)結束收獲細胞，常規(guī)制備染色體，操作同實驗一。
4．染色體制片在37℃恒溫箱內老化24小時或室溫放置1—2天。
5．將染色體制片的玻片正面向上平鋪在恒溫（45℃）水浴鍋上，在玻片上滴加已預熱至45℃的1×SSC溶液。
6．將紫外燈放在恒溫水浴上，燈與標本垂直，其外加蓋報紙數張以阻擋紫外線。照射距離為6cm，時間15min。
7．照射完畢后以蒸餾水洗去1×SSC。
8．1∶10 Giemsa染色5分鐘。
9．自來水細流沖洗去多余染料，干燥，鏡檢。
10．計數SCE。選擇染色體分散較好，數目為46的中期分裂相20個進行觀察計數，凡在染色單體端部出現(xiàn)的互換計為一次SCE，在染色單體中間出現(xiàn)的互換計為兩次SCE。凡在著絲粒部位發(fā)生一次互換，判斷不是兩條染色單體在著絲粒部發(fā)生的扭轉，計為一次SCE，但另列入“著絲粒區(qū)互換（CME）”一項。