一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />本實(shí)驗(yàn)以酵母RNA為材料，將RNA用堿水解成單核苷酸，再用離子交換柱層析進(jìn)行分離，最后采用紫外吸收法進(jìn)行鑒定。同時(shí)通過測(cè)定各單核苷酸的含量，可以計(jì)算出酵母RNA的堿基組成。
本實(shí)驗(yàn)的目的是：
1. 了解掌握RNA堿水解的原理和方法
2. 掌握離子交換柱層析的分離原理和方法
3. 熟練掌握紫外吸收分析方法
二、實(shí)驗(yàn)原理
1. RNA的堿水解
實(shí)驗(yàn)室制備單核苷酸一般用化學(xué)水解法（酸、堿水解）和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤堿基；用堿水解可得到2’一核苷酸和3’一核苷酸的混合物；用5’一磷酸二酯酶或3’一磷酸二酯酶水解則分別可得到5’一核苷酸或3’一核苷酸。
RNA用堿水解，經(jīng)過2’、3’一環(huán)核苷酸中間物，而后水解生成2’一核苷酸和3’一核苷酸。如下圖所示。
堿水解一般采用0.3M的KOH，37℃保溫18~20小時(shí)就能水解完全（也可以用1M KOH，80℃水解60min或0.1M KOH 100℃水解20min）。水解畢，用2M HClO4中和并逐滴調(diào)節(jié)至pH=2左右，生成的KClO4沉淀，離心去除之。上清液即為各單核苷酸的混合液。然后根據(jù)所選離子交換劑的類型，將上清液調(diào)至適當(dāng)?shù)膒H值，作樣品液備用。一般用陽(yáng)離子交換劑，pH調(diào)至1.5左右，用陰離子交換劑，pH調(diào)至8 ~ 9(逐滴)。此處用KOH是為了便于除去鉀離子以降低樣品溶液中的離子強(qiáng)度。
2. 單核苷酸的離子交換柱層析分離
離子交換層析是根據(jù)各種物質(zhì)帶電狀態(tài)（或極性）的差別來進(jìn)行分離的。電荷不同的物質(zhì)對(duì)離子交換劑有不同的親和力，因此，要成功地分離某種混合物，必須根據(jù)其所含物質(zhì)的解離性質(zhì)，帶電狀態(tài)選擇適當(dāng)類型的離子交換劑，并控制吸附和洗脫條件（主要是洗脫液的離子強(qiáng)度和pH值）,使混合物中各組分按親和力大小順序依次從層析柱中洗脫下來。
在離子交換層析中，分配系數(shù)或平衡常數(shù)（Kd）是一個(gè)重要的參數(shù)：
Kd = Cs / Cm
式中：Cs是某物質(zhì)在固定相（交換劑）上的摩爾濃度，Cm是該物質(zhì)在流動(dòng)相中的摩爾濃度。可以看出，與交換劑的親和力越大，Cs越大，Kd值也越大。各種物質(zhì)Kd值差異的大小決定了分離的效果。差異越大，分離效果越好。影響Kd值的因素很多，如被分離物帶電荷多少，空間結(jié)構(gòu)因素，離子交換劑的非極性親和力大小，溫度高低等。實(shí)驗(yàn)中必須反復(fù)摸索條件，才能得到最佳分離效果。
核苷酸分子中各基團(tuán)的解離常數(shù)（pK）和等電點(diǎn) p I 值見表1。
表 1 四種核苷酸的解離常數(shù)（pK）和等電點(diǎn)pI值
核苷酸 第一磷酸基 pKa1 第二磷酸基 pKa2 含氮環(huán)的亞氨基（－NH =） pKa3 等電點(diǎn) pI值*
尿苷酸UMP鳥苷酸GMP腺苷酸AMP胞苷酸CMP 1.0 0.7 0.9 0.8 6.4 6.1 6.2 6.3 2.4 3.7 4.5 1.55 2.35 2.65
*注：pI = (pKa1 pKa3) / 2
由表1可見,含氮環(huán)亞氨基的解離常數(shù)（ pK ）值相差較大，它在離子交換分離四種核苷酸中將起決定作用。
用離子交換樹脂分離核苷酸，可通過調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值使它們的可解離基團(tuán)解離，帶上正電荷或負(fù)電荷。同時(shí)減少樣品溶液中除核苷酸外的其它離子的強(qiáng)度。這樣，當(dāng)樣品液加入到層析柱時(shí)，核苷酸就可以與離子交換樹脂相結(jié)合。洗脫時(shí)，通過改變pH值或增加洗脫液中競(jìng)爭(zhēng)性離子的強(qiáng)度，使被吸附的核苷酸的相應(yīng)電荷降低，與樹脂的親和力降低，結(jié)果使核苷酸得到分離。
混合核苷酸可以用陽(yáng)離子或陰離子交換樹脂進(jìn)行分離。采用陽(yáng)離子交換時(shí)，控制樣品液pH值在1.5，此時(shí)UMP帶負(fù)電，而AMP、CMP、GMP帶正電，可被陽(yáng)離子樹脂吸附。然后通過逐漸升高pH值，將各核甘酸洗脫下來，次序是UMP-GMP-CMP-AMP。AMP與CMP洗脫位置的互換，是由于聚苯乙烯樹脂母體對(duì)嘌呤堿基的非極性吸附力大于對(duì)嘧啶堿基的吸附力造成的。
本實(shí)驗(yàn)采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季銨堿型粉末陰離子樹脂（201×8）分離四種核苷酸.首先使RNA堿水解液中的其它離子強(qiáng)度降至0.02以下，然后調(diào)pH值至6以上，使樣品核苷酸都帶上負(fù)電荷，它們都能與陰離子交換樹脂結(jié)合。結(jié)合能力的強(qiáng)弱，與核苷酸的pI 值有關(guān)，pI 越大，與陰離子交換樹脂的結(jié)合力越 弱，洗脫時(shí)越易交換下來。由表1可見，當(dāng)用含競(jìng)爭(zhēng)性離子的洗脫液進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫下來的次序應(yīng)該是CMP、AMP、GMP和UMP。由于本實(shí)驗(yàn)所用的樹脂的不溶性基質(zhì)是非極性的,它與嘌呤堿基的非極性親和力大于與嘧啶堿基的非極性親和力。所以，實(shí)際洗脫下來的次序?yàn)椋篊MP、AMP、UMP和GMP。對(duì)于同一種核甘酸的不同異構(gòu)體而言，它們之間的差別僅在于磷酸基位于核糖的不同位置上，2’—磷酸基較3’—磷酸基距離堿基更近，因而它的負(fù)電性對(duì)堿基正電荷的電中和影響較大,其pK 值也較大。例如2’-胞苷酸的pK1=4.4 ，3’-胞苷酸的pK1 = 4.3 ，因此2’一核苷酸更易被洗脫下來。
應(yīng)注意的是，樣品不易過濃，洗脫的流速不宜過快，洗脫液的pH值要嚴(yán)格控制。否則將使吸附不完全，洗脫峰平坦而使各核苷酸分離不清。
3. 核苷酸的鑒定
由于核苷酸中都含有嘌呤與嘧啶堿基，這些堿基都具有共軛雙鍵（—C=C—C=C—），它能夠強(qiáng)烈地吸收250~280毫微米波段的紫外光，而且有特征的紫外吸收比值。因此，通過測(cè)定各洗脫峰溶液在220~300毫微米波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸收值，作出紫外吸收光譜圖，與下圖所示的標(biāo)準(zhǔn)吸收光譜進(jìn)行比較，并根據(jù)其吸光度比值（250nm/260nm, 280nm/260nm, 290nm/260nm）以及最大吸收峰與下頁(yè)“表2”所列標(biāo)準(zhǔn)值比較后，即可判斷各組分為何種核苷酸。
根據(jù)各組分在其最大吸收波長(zhǎng)（lmax）處總的吸光度（總Amax ）以及相應(yīng)的摩爾消光系數(shù)（E260 nm）, 可以計(jì)算出RNA中四種核苷酸的微摩爾數(shù)和堿基摩爾數(shù)百分組成。
四種核苷酸在pH = 2 ~ 4時(shí)的紫外吸收光譜曲線
（1）
（2）
溶液的pH值對(duì)核苷酸的紫外吸收光度值影響較大，故測(cè)定時(shí)需要調(diào)至一定的pH值。
三、試劑與器材
試劑：
1. 酵母RNA
2. 強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂201×8。聚苯乙烯 一 二乙烯苯 一 三甲胺季銨堿型，全交換量大于3毫摩爾/克干樹脂，粉末型100~200目。
3. 1M甲酸：21.4ml 88%甲酸定容至500ml。
4. 1M甲酸鈉：34.15g純甲酸鈉（注意結(jié)晶水問題）用蒸餾水溶解，定容至500ml。
5. 0.3 M KOH: 1.68g KOH用蒸餾水溶解定容至 100ml。
6. 2 M過氯酸HClO4：17ml 過氯酸( 70~72 % )定容至100ml。
7. 2 M NaOH (50ml)，0.5 M NaOH (100ml)。
8. 1M HCl（100ml）。
9. 1% AgNO3溶液。
器材：
1. 層析柱
2. 梯度洗脫器，電磁攪拌器
3. 恒流泵
4. 自動(dòng)部分收集器
5. 酸度計(jì)
6. 紫外分光光度計(jì)
7. 旋渦混合器
8. 核酸蛋白檢測(cè)儀
9. 臺(tái)式離心機(jī)
四、操作步驟
1. RNA的堿水解：
稱取20mg酵母RNA，置于刻度離心試管中，加2ml新配制的0.3 M KOH, 用細(xì)玻璃棒攪拌溶解，于37℃水浴中保溫水解20小時(shí)。然后用2M HClO4（過氯酸）調(diào)水解液pH至2以下（要少量多次，只需幾滴即可）。由于核苷酸在過酸的條件下易脫嘌呤，所以滴加HClO4時(shí)需用旋渦混合器迅速攪拌，防止局部過酸，再以4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，置冰浴中10分鐘，以沉淀完全。將清液倒入另一刻度試管中，用2 M NaOH逐滴將清液pH值調(diào)至8～9，作上樣樣品液備用。樣品液上柱前，取0.1ml稀釋到500倍，測(cè)定其在260nm波長(zhǎng)處的光吸收值，用以最后計(jì)算離子交換柱層析的回收率。
2. 離子交換樹脂的預(yù)處理：
取201×8粉末型強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂8克（濕），先用蒸餾水浸泡2小時(shí)，浮選除去細(xì)小顆粒，同時(shí)用減壓法除去樹脂中存留的氣泡，然后用四倍樹脂量的0.5M NaOH溶液浸泡1小時(shí)，除去樹脂中的堿溶性雜質(zhì)。用去離子水洗至近中性后，再用四倍量 1M HCl浸泡半小時(shí)，以除去樹脂中酸溶性雜質(zhì)。接著用蒸餾水洗至中性（可以上柱洗），此時(shí)陰離子交換樹脂為氯型。
3. 離子交換層析柱的裝柱方法：
離子交換層析柱可使用內(nèi)徑約1cm、長(zhǎng)10 cm的層析柱，柱下端有燒結(jié)上的垂熔濾板，柱上端使用橡皮塞，塞子中間打一小孔。緊緊插入一根細(xì)聚乙烯管，層析柱夾在鐵架臺(tái)上，調(diào)成垂直，柱下端細(xì)膠管用螺旋夾夾緊，向柱內(nèi)加入蒸餾水至2/3柱高，再用滴管將經(jīng)過預(yù) 處理的離子交換樹脂加入柱內(nèi)，使樹脂自由沉降至柱底，放松螺旋夾，使 蒸餾水緩慢流出，再繼續(xù)加入樹脂，使樹脂最后沉降的高度約為6~7cm.。注意在裝柱和以后使用層析柱的過程中，切勿干柱，樹脂不能分層，樹脂面以上要保持一定高度的液面（不能太高，約1cm），以防氣泡進(jìn)入樹脂內(nèi)部，影響分離效果。
4. 樹脂的轉(zhuǎn)型處理：
樹脂的轉(zhuǎn)型處理就是使樹脂帶上洗脫時(shí)所需要的離子。本實(shí)驗(yàn)需要將陰離子交換樹脂由氯型轉(zhuǎn)變?yōu)榧姿嵝停扔?00ml 1M 甲酸鈉洗柱，用1%AgNO3檢查柱流出液，直至不出現(xiàn)白色AgCl沉淀為止。然后改用約200ml 0.2M甲酸繼續(xù)洗柱，測(cè)定流出液的A260 ≤ 0.020為止。最后用蒸餾水洗柱，直至流出液的pH值接近中性（或與蒸餾水的pH相同）。
5. 加入樣品并淋洗除去不被樹脂吸附的組分：
加樣就是將RNA堿水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到離子交換層析柱內(nèi)，使其被離子交換樹脂吸附。先將柱內(nèi)液體用滴管輕輕吸去，使液面下降到剛接近樹脂表面。旋緊下端螺旋夾，用滴管準(zhǔn)確移取1.0 ml RNA堿水解樣品液，沿柱壁小心加到樹脂表面，然后松開下端螺旋夾，使樣品液面下降至樹脂表面，接著用滴管加入少量蒸餾水，當(dāng)水面降至樹脂表面時(shí)，再用約200ml蒸餾水洗柱，將不被陰離子交換樹脂吸附的嘌呤及嘧啶堿基，核苷等雜質(zhì)洗下來。檢查流出液在260nm波長(zhǎng)處的吸光度，直至低于0.020為止。關(guān)恒流泵，旋緊柱下端螺旋夾。
6. 梯度洗脫：
在梯度洗脫器的混合瓶?jī)?nèi)加入300ml蒸餾水，貯液瓶中加入300ml 0.20M甲酸—0.20M甲酸鈉混合液（注意：梯度洗脫器底部的連通管要事先充滿蒸餾水，趕盡氣泡）。洗脫器出口與恒流泵入口用細(xì)塑料管相連，打開兩瓶之間的連通伐和出口伐，打開電磁攪拌器，松開柱下端螺旋夾，開啟恒流泵，控制 流速為5ml / 管 / 10分，開啟部份收集器，分管收集流出液。以蒸餾水為對(duì)照，測(cè)定各管在260nm波長(zhǎng)下的A260值，，給各管編號(hào)，并標(biāo)出最高峰的收集管。
7. 核苷酸的鑒定：
分別測(cè)定最高峰管內(nèi)液體在230nm ~ 300nm之間，每相差5nm間隔的光吸收值。其中包括有250、260、280，290nm各點(diǎn)（注意：液體均要保留，切勿倒掉。測(cè)量時(shí)用石英杯）。由于在小于250nm時(shí)，甲酸（ HCOOH ）具有很強(qiáng)的光吸收值，因此測(cè)定時(shí)所用參比對(duì)照液近似為：
第一個(gè)峰用0.05M甲酸—0.05M 甲酸鈉
第二個(gè)峰用0.10M甲酸—0.10M甲酸鈉
第三個(gè)峰用0.15M甲酸—0.15M甲酸鈉
第四，五兩峰用0.20M甲酸¾ 0.20M甲酸鈉
也可以根據(jù)最高峰所在位置，計(jì)算甲酸、甲酸鈉的濃度選擇參比液。
8. 測(cè)定各種核苷酸的含量和總回收率：
分別合并（包括最高峰管在內(nèi)）各組份洗脫峰管內(nèi)的洗脫液，用量筒測(cè)出溶液總體積，然后測(cè)定其 A260值，參比對(duì)照液同上。根據(jù)層析柱上樣液的A260值以及層析后所得到的各組份A260值之和，可以計(jì)算出離子交換柱層析的回收率。（注：RNA 的摩爾消光系數(shù)E260nm為 7.7 ~ 7.8×10³，水解后增值 40 % )。
9. 樹脂的再生：
使用過的離子交換樹脂經(jīng)過再生處理后，可重復(fù)使用。可以在柱內(nèi)處理，也可以將樹脂取出后處理。取出樹脂的方法是用橡皮球由層析柱的下端向柱內(nèi)吹氣，用燒杯收集流出的樹脂。樹脂再生的方法與未使用的新樹脂預(yù)處理方法相同。也可以直接用1M NaCl溶液浸泡或洗滌，最后用蒸餾水洗至流出液的pH值接近中性。
五、結(jié)果處理
1. 作出陰離子交換樹脂柱層析分離核苷酸的洗脫曲線，以層析流出液管數(shù)（或體積）為橫座標(biāo)，以相應(yīng)的A 260值為縱座標(biāo)，作出洗脫曲線圖。
2. 作出各單核苷酸的紫外吸收光譜圖，根據(jù)各組份溶液在230~300nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度值，以波長(zhǎng)（nm）為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，作出它們的吸收光譜圖。由圖上求出每個(gè)單核苷酸組分的最大吸收峰的波長(zhǎng)值 lmax ，同時(shí)，計(jì)算出各個(gè)組份在不同波長(zhǎng)的吸光度值比值（250/260，280/260，290/260），將它們與各核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)值（見表2，取pH=2和pH=7兩組值的平均值為標(biāo)準(zhǔn)值）列表比較，從而鑒定出各組份為何種核苷酸。
3. 根據(jù)各組份溶液的合并體積（V），平均吸光度值（A260）,再查出該核苷酸的摩爾消光系數(shù)（E260），從而可以計(jì)算出每個(gè)核苷酸的微摩爾數(shù)（m）。
因?yàn)椋?m = C · V
濃度 L（比色杯光程）= 1 cm
則： ( 微摩爾 )
由此，可以計(jì)算出各核苷酸的相對(duì)摩爾百分含量以及嘌呤與嘧啶的相對(duì)摩爾數(shù)比值。然后討論RNA中嘌呤與嘧啶的摩爾數(shù)比值關(guān)系。
4. 根據(jù)層析上樣液 A260值，以及層析后所得到的各組份 A260值之和，計(jì)算出離子交換柱層析的回收率。
