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離子交換柱層析分離核苷酸

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />本實(shí)驗(yàn)以酵母RNA為材料,將RNA用堿水解成單核苷酸,再用離子交換柱層析進(jìn)行分離,最后采用紫外吸收法進(jìn)行鑒定。同時(shí)通過測(cè)定各單核苷酸的含量,可以計(jì)算出酵母RNA的堿基組成。
本實(shí)驗(yàn)的目的是:
1. 了解掌握RNA堿水解的原理和方法
2. 掌握離子交換柱層析的分離原理和方法
3. 熟練掌握紫外吸收分析方法
二、實(shí)驗(yàn)原理
1. RNA的堿水解
實(shí)驗(yàn)室制備單核苷酸一般用化學(xué)水解法(酸、堿水解)和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤堿基;用堿水解可得到2’一核苷酸和3’一核苷酸的混合物;用5’一磷酸二酯酶或3’一磷酸二酯酶水解則分別可得到5’一核苷酸或3’一核苷酸。
RNA用堿水解,經(jīng)過2’、3’一環(huán)核苷酸中間物,而后水解生成2’一核苷酸和3’一核苷酸。如下圖所示。
堿水解一般采用0.3M的KOH,37℃保溫18~20小時(shí)就能水解完全(也可以用1M KOH,80℃水解60min或0.1M KOH 100℃水解20min)。水解畢,用2M HClO4中和并逐滴調(diào)節(jié)至pH=2左右,生成的KClO4沉淀,離心去除之。上清液即為各單核苷酸的混合液。然后根據(jù)所選離子交換劑的類型,將上清液調(diào)至適當(dāng)?shù)膒H值,作樣品液備用。一般用陽離子交換劑,pH調(diào)至1.5左右,用陰離子交換劑,pH調(diào)至8 ~ 9(逐滴)。此處用KOH是為了便于除去鉀離子以降低樣品溶液中的離子強(qiáng)度。
2. 單核苷酸的離子交換柱層析分離
離子交換層析是根據(jù)各種物質(zhì)帶電狀態(tài)(或極性)的差別來進(jìn)行分離的。電荷不同的物質(zhì)對(duì)離子交換劑有不同的親和力,因此,要成功地分離某種混合物,必須根據(jù)其所含物質(zhì)的解離性質(zhì),帶電狀態(tài)選擇適當(dāng)類型的離子交換劑,并控制吸附和洗脫條件(主要是洗脫液的離子強(qiáng)度和pH值),使混合物中各組分按親和力大小順序依次從層析柱中洗脫下來。
在離子交換層析中,分配系數(shù)或平衡常數(shù)(Kd)是一個(gè)重要的參數(shù):
Kd = Cs / Cm
式中:Cs是某物質(zhì)在固定相(交換劑)上的摩爾濃度,Cm是該物質(zhì)在流動(dòng)相中的摩爾濃度?梢钥闯,與交換劑的親和力越大,Cs越大,Kd值也越大。各種物質(zhì)Kd值差異的大小決定了分離的效果。差異越大,分離效果越好。影響Kd值的因素很多,如被分離物帶電荷多少,空間結(jié)構(gòu)因素,離子交換劑的非極性親和力大小,溫度高低等。實(shí)驗(yàn)中必須反復(fù)摸索條件,才能得到最佳分離效果。
核苷酸分子中各基團(tuán)的解離常數(shù)(pK)和等電點(diǎn) p I 值見表1。

表 1 四種核苷酸的解離常數(shù)(pK)和等電點(diǎn)pI值

核苷酸 第一磷酸基 pKa1 第二磷酸基 pKa2 含氮環(huán)的亞氨基(-NH =) pKa3 等電點(diǎn) pI值*
尿苷酸UMP鳥苷酸GMP腺苷酸AMP胞苷酸CMP 1.0 0.7 0.9 0.8 6.4 6.1 6.2 6.3 2.4 3.7 4.5 1.55 2.35 2.65
*注:pI = (pKa1 pKa3) / 2

由表1可見,含氮環(huán)亞氨基的解離常數(shù)( pK )值相差較大,它在離子交換分離四種核苷酸中將起決定作用。
用離子交換樹脂分離核苷酸,可通過調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值使它們的可解離基團(tuán)解離,帶上正電荷或負(fù)電荷。同時(shí)減少樣品溶液中除核苷酸外的其它離子的強(qiáng)度。這樣,當(dāng)樣品液加入到層析柱時(shí),核苷酸就可以與離子交換樹脂相結(jié)合。洗脫時(shí),通過改變pH值或增加洗脫液中競(jìng)爭(zhēng)性離子的強(qiáng)度,使被吸附的核苷酸的相應(yīng)電荷降低,與樹脂的親和力降低,結(jié)果使核苷酸得到分離。
混合核苷酸可以用陽離子或陰離子交換樹脂進(jìn)行分離。采用陽離子交換時(shí),控制樣品液pH值在1.5,此時(shí)UMP帶負(fù)電,而AMP、CMP、GMP帶正電,可被陽離子樹脂吸附。然后通過逐漸升高pH值,將各核甘酸洗脫下來,次序是UMP-GMP-CMP-AMP。AMP與CMP洗脫位置的互換,是由于聚苯乙烯樹脂母體對(duì)嘌呤堿基的非極性吸附力大于對(duì)嘧啶堿基的吸附力造成的。
本實(shí)驗(yàn)采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季銨堿型粉末陰離子樹脂(201×8)分離四種核苷酸.首先使RNA堿水解液中的其它離子強(qiáng)度降至0.02以下,然后調(diào)pH值至6以上,使樣品核苷酸都帶上負(fù)電荷,它們都能與陰離子交換樹脂結(jié)合。結(jié)合能力的強(qiáng)弱,與核苷酸的pI 值有關(guān),pI 越大,與陰離子交換樹脂的結(jié)合力越 弱,洗脫時(shí)越易交換下來。由表1可見,當(dāng)用含競(jìng)爭(zhēng)性離子的洗脫液進(jìn)行洗脫時(shí),洗脫下來的次序應(yīng)該是CMP、AMP、GMP和UMP。由于本實(shí)驗(yàn)所用的樹脂的不溶性基質(zhì)是非極性的,它與嘌呤堿基的非極性親和力大于與嘧啶堿基的非極性親和力。所以,實(shí)際洗脫下來的次序?yàn)椋篊MP、AMP、UMP和GMP。對(duì)于同一種核甘酸的不同異構(gòu)體而言,它們之間的差別僅在于磷酸基位于核糖的不同位置上,2’—磷酸基較3’—磷酸基距離堿基更近,因而它的負(fù)電性對(duì)堿基正電荷的電中和影響較大,其pK 值也較大。例如2’-胞苷酸的pK1=4.4 ,3’-胞苷酸的pK1 = 4.3 ,因此2’一核苷酸更易被洗脫下來。
應(yīng)注意的是,樣品不易過濃,洗脫的流速不宜過快,洗脫液的pH值要嚴(yán)格控制。否則將使吸附不完全,洗脫峰平坦而使各核苷酸分離不清。
3. 核苷酸的鑒定
由于核苷酸中都含有嘌呤與嘧啶堿基,這些堿基都具有共軛雙鍵(—C=C—C=C—),它能夠強(qiáng)烈地吸收250~280毫微米波段的紫外光,而且有特征的紫外吸收比值。因此,通過測(cè)定各洗脫峰溶液在220~300毫微米波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸收值,作出紫外吸收光譜圖,與下圖所示的標(biāo)準(zhǔn)吸收光譜進(jìn)行比較,并根據(jù)其吸光度比值(250nm/260nm, 280nm/260nm, 290nm/260nm)以及最大吸收峰與下頁“表2”所列標(biāo)準(zhǔn)值比較后,即可判斷各組分為何種核苷酸。
根據(jù)各組分在其最大吸收波長(zhǎng)(lmax)處總的吸光度(總Amax )以及相應(yīng)的摩爾消光系數(shù)(E260 nm), 可以計(jì)算出RNA中四種核苷酸的微摩爾數(shù)和堿基摩爾數(shù)百分組成。

四種核苷酸在pH = 2 ~ 4時(shí)的紫外吸收光譜曲線


(1)

(2)

溶液的pH值對(duì)核苷酸的紫外吸收光度值影響較大,故測(cè)定時(shí)需要調(diào)至一定的pH值。
三、試劑與器材
試劑:
1. 酵母RNA
2. 強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂201×8。聚苯乙烯 一 二乙烯苯 一 三甲胺季銨堿型,全交換量大于3毫摩爾/克干樹脂,粉末型100~200目。
3. 1M甲酸:21.4ml 88%甲酸定容至500ml。
4. 1M甲酸鈉:34.15g純甲酸鈉(注意結(jié)晶水問題)用蒸餾水溶解,定容至500ml。
5. 0.3 M KOH: 1.68g KOH用蒸餾水溶解定容至 100ml。
6. 2 M過氯酸HClO4:17ml 過氯酸( 70~72 % )定容至100ml。
7. 2 M NaOH (50ml),0.5 M NaOH (100ml)。
8. 1M HCl(100ml)。
9. 1% AgNO3溶液。
器材:
1. 層析柱
2. 梯度洗脫器,電磁攪拌器
3. 恒流泵
4. 自動(dòng)部分收集器
5. 酸度計(jì)
6. 紫外分光光度計(jì)
7. 旋渦混合器
8. 核酸蛋白檢測(cè)儀
9. 臺(tái)式離心機(jī)
四、操作步驟
1. RNA的堿水解:
稱取20mg酵母RNA,置于刻度離心試管中,加2ml新配制的0.3 M KOH, 用細(xì)玻璃棒攪拌溶解,于37℃水浴中保溫水解20小時(shí)。然后用2M HClO4(過氯酸)調(diào)水解液pH至2以下(要少量多次,只需幾滴即可)。由于核苷酸在過酸的條件下易脫嘌呤,所以滴加HClO4時(shí)需用旋渦混合器迅速攪拌,防止局部過酸,再以4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15分鐘,置冰浴中10分鐘,以沉淀完全。將清液倒入另一刻度試管中,用2 M NaOH逐滴將清液pH值調(diào)至8~9,作上樣樣品液備用。樣品液上柱前,取0.1ml稀釋到500倍,測(cè)定其在260nm波長(zhǎng)處的光吸收值,用以最后計(jì)算離子交換柱層析的回收率。
2. 離子交換樹脂的預(yù)處理:
取201×8粉末型強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂8克(濕),先用蒸餾水浸泡2小時(shí),浮選除去細(xì)小顆粒,同時(shí)用減壓法除去樹脂中存留的氣泡,然后用四倍樹脂量的0.5M NaOH溶液浸泡1小時(shí),除去樹脂中的堿溶性雜質(zhì)。用去離子水洗至近中性后,再用四倍量 1M HCl浸泡半小時(shí),以除去樹脂中酸溶性雜質(zhì)。接著用蒸餾水洗至中性(可以上柱洗),此時(shí)陰離子交換樹脂為氯型。
3. 離子交換層析柱的裝柱方法:
離子交換層析柱可使用內(nèi)徑約1cm、長(zhǎng)10 cm的層析柱,柱下端有燒結(jié)上的垂熔濾板,柱上端使用橡皮塞,塞子中間打一小孔。緊緊插入一根細(xì)聚乙烯管,層析柱夾在鐵架臺(tái)上,調(diào)成垂直,柱下端細(xì)膠管用螺旋夾夾緊,向柱內(nèi)加入蒸餾水至2/3柱高,再用滴管將經(jīng)過預(yù) 處理的離子交換樹脂加入柱內(nèi),使樹脂自由沉降至柱底,放松螺旋夾,使 蒸餾水緩慢流出,再繼續(xù)加入樹脂,使樹脂最后沉降的高度約為6~7cm.。注意在裝柱和以后使用層析柱的過程中,切勿干柱,樹脂不能分層,樹脂面以上要保持一定高度的液面(不能太高,約1cm),以防氣泡進(jìn)入樹脂內(nèi)部,影響分離效果。
4. 樹脂的轉(zhuǎn)型處理:
樹脂的轉(zhuǎn)型處理就是使樹脂帶上洗脫時(shí)所需要的離子。本實(shí)驗(yàn)需要將陰離子交換樹脂由氯型轉(zhuǎn)變?yōu)榧姿嵝,先?00ml 1M 甲酸鈉洗柱,用1%AgNO3檢查柱流出液,直至不出現(xiàn)白色AgCl沉淀為止。然后改用約200ml 0.2M甲酸繼續(xù)洗柱,測(cè)定流出液的A260 ≤ 0.020為止。最后用蒸餾水洗柱,直至流出液的pH值接近中性(或與蒸餾水的pH相同)。
5. 加入樣品并淋洗除去不被樹脂吸附的組分:
加樣就是將RNA堿水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到離子交換層析柱內(nèi),使其被離子交換樹脂吸附。先將柱內(nèi)液體用滴管輕輕吸去,使液面下降到剛接近樹脂表面。旋緊下端螺旋夾,用滴管準(zhǔn)確移取1.0 ml RNA堿水解樣品液,沿柱壁小心加到樹脂表面,然后松開下端螺旋夾,使樣品液面下降至樹脂表面,接著用滴管加入少量蒸餾水,當(dāng)水面降至樹脂表面時(shí),再用約200ml蒸餾水洗柱,將不被陰離子交換樹脂吸附的嘌呤及嘧啶堿基,核苷等雜質(zhì)洗下來。檢查流出液在260nm波長(zhǎng)處的吸光度,直至低于0.020為止。關(guān)恒流泵,旋緊柱下端螺旋夾。
6. 梯度洗脫:
在梯度洗脫器的混合瓶?jī)?nèi)加入300ml蒸餾水,貯液瓶中加入300ml 0.20M甲酸—0.20M甲酸鈉混合液(注意:梯度洗脫器底部的連通管要事先充滿蒸餾水,趕盡氣泡)。洗脫器出口與恒流泵入口用細(xì)塑料管相連,打開兩瓶之間的連通伐和出口伐,打開電磁攪拌器,松開柱下端螺旋夾,開啟恒流泵,控制 流速為5ml / 管 / 10分,開啟部份收集器,分管收集流出液。以蒸餾水為對(duì)照,測(cè)定各管在260nm波長(zhǎng)下的A260值,,給各管編號(hào),并標(biāo)出最高峰的收集管。
7. 核苷酸的鑒定:
分別測(cè)定最高峰管內(nèi)液體在230nm ~ 300nm之間,每相差5nm間隔的光吸收值。其中包括有250、260、280,290nm各點(diǎn)(注意:液體均要保留,切勿倒掉。測(cè)量時(shí)用石英杯)。由于在小于250nm時(shí),甲酸( HCOOH )具有很強(qiáng)的光吸收值,因此測(cè)定時(shí)所用參比對(duì)照液近似為:
第一個(gè)峰用0.05M甲酸—0.05M 甲酸鈉
第二個(gè)峰用0.10M甲酸—0.10M甲酸鈉
第三個(gè)峰用0.15M甲酸—0.15M甲酸鈉
第四,五兩峰用0.20M甲酸¾ 0.20M甲酸鈉
也可以根據(jù)最高峰所在位置,計(jì)算甲酸、甲酸鈉的濃度選擇參比液。
8. 測(cè)定各種核苷酸的含量和總回收率:
分別合并(包括最高峰管在內(nèi))各組份洗脫峰管內(nèi)的洗脫液,用量筒測(cè)出溶液總體積,然后測(cè)定其 A260值,參比對(duì)照液同上。根據(jù)層析柱上樣液的A260值以及層析后所得到的各組份A260值之和,可以計(jì)算出離子交換柱層析的回收率。(注:RNA 的摩爾消光系數(shù)E260nm為 7.7 ~ 7.8×10³,水解后增值 40 % )。
9. 樹脂的再生:
使用過的離子交換樹脂經(jīng)過再生處理后,可重復(fù)使用?梢栽谥鶅(nèi)處理,也可以將樹脂取出后處理。取出樹脂的方法是用橡皮球由層析柱的下端向柱內(nèi)吹氣,用燒杯收集流出的樹脂。樹脂再生的方法與未使用的新樹脂預(yù)處理方法相同。也可以直接用1M NaCl溶液浸泡或洗滌,最后用蒸餾水洗至流出液的pH值接近中性。
五、結(jié)果處理
1. 作出陰離子交換樹脂柱層析分離核苷酸的洗脫曲線,以層析流出液管數(shù)(或體積)為橫座標(biāo),以相應(yīng)的A 260值為縱座標(biāo),作出洗脫曲線圖。
2. 作出各單核苷酸的紫外吸收光譜圖,根據(jù)各組份溶液在230~300nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度值,以波長(zhǎng)(nm)為橫座標(biāo),吸光度值為縱座標(biāo),作出它們的吸收光譜圖。由圖上求出每個(gè)單核苷酸組分的最大吸收峰的波長(zhǎng)值 lmax ,同時(shí),計(jì)算出各個(gè)組份在不同波長(zhǎng)的吸光度值比值(250/260,280/260,290/260),將它們與各核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)值(見表2,取pH=2和pH=7兩組值的平均值為標(biāo)準(zhǔn)值)列表比較,從而鑒定出各組份為何種核苷酸。
3. 根據(jù)各組份溶液的合并體積(V),平均吸光度值(A260),再查出該核苷酸的摩爾消光系數(shù)(E260),從而可以計(jì)算出每個(gè)核苷酸的微摩爾數(shù)(m)。
因?yàn)椋?m = C · V
濃度 L(比色杯光程)= 1 cm
則: ( 微摩爾 )
由此,可以計(jì)算出各核苷酸的相對(duì)摩爾百分含量以及嘌呤與嘧啶的相對(duì)摩爾數(shù)比值。然后討論RNA中嘌呤與嘧啶的摩爾數(shù)比值關(guān)系。
4. 根據(jù)層析上樣液 A260值,以及層析后所得到的各組份 A260值之和,計(jì)算出離子交換柱層析的回收率。

 
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