RT-PCR簡介
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。使用天為時(shí)代公司的總RNA提取系統(tǒng)（如目錄號 DP405和DP406），所獲得的RNA的純度高，基因組DNA污染少，用于RT-PCR系統(tǒng)可得到滿意結(jié)果。
用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可。
RT-PCR引物的選擇
隨機(jī)引物 適用于長的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)。
Oligo dT 適用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要結(jié)合到PolyA 尾巴上，所以對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，即使有少量降解也 會(huì)使全長cDNA合成量大大減少。
基因特異性引物 與模板序列互補(bǔ)的引物，適用于目的序列已知的情況。天為時(shí) 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特別適合于與基因特異性 引物連用。
RT-PCR影響因素
RT-PCR反應(yīng)受多個(gè)因素影響，如硫酸鎂的濃度, 引物退火的溫度，擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)等。
◇建議選擇0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸鎂作初步實(shí)驗(yàn)。
◇對于具有較高Tm的引物，增加退火和延伸時(shí)的溫度對反應(yīng)有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結(jié)合，因而提高特異產(chǎn)物的得率。
◇大多數(shù)目標(biāo)RNA經(jīng)40輪PCR反應(yīng)就能觀察到。但如果目標(biāo)RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴(kuò)增的次數(shù)到45-50次。
