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RT-PCR技術(shù)概述

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

RT-PCR簡介

RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA,再以cDNA為模板,擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛,可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平,細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA,關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。使用天為時代公司的總RNA提取系統(tǒng)(如目錄號 DP405和DP406),所獲得的RNA的純度高,基因組DNA污染少,用于RT-PCR系統(tǒng)可得到滿意結(jié)果。

  用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA,三種都可。

RT-PCR引物的選擇

隨機(jī)引物 適用于長的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)。
Oligo dT 適用于具有PolyA尾巴的RNA。(原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。)由于Oligo dT要結(jié)合到PolyA 尾巴上,所以對RNA樣品的質(zhì)量要求較高,即使有少量降解也 會使全長cDNA合成量大大減少。
基因特異性引物 與模板序列互補(bǔ)的引物,適用于目的序列已知的情況。天為時 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特別適合于與基因特異性 引物連用。

RT-PCR影響因素

RT-PCR反應(yīng)受多個因素影響,如硫酸鎂的濃度, 引物退火的溫度,擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)等。

◇建議選擇0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸鎂作初步實(shí)驗(yàn)。

◇對于具有較高Tm的引物,增加退火和延伸時的溫度對反應(yīng)有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結(jié)合,因而提高特異產(chǎn)物的得率。

◇大多數(shù)目標(biāo)RNA經(jīng)40輪PCR反應(yīng)就能觀察到。但如果目標(biāo)RNA太稀少,或者只有很少的起始材料,有必要增加擴(kuò)增的次數(shù)到45-50次。

 
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