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甲醇酵母表達系統(tǒng)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

甲醇酵母基因表達系統(tǒng)是一種最近發(fā)展迅速的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)。甲醇酵母是可利用甲醇作為唯一碳源的酵母,主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三種,其中Pichia Pastoris作為基因表達系統(tǒng)使用得最多、最廣泛[1]。與以往的基因表達系統(tǒng)相比,它具有無可匹敵的高表達特性,已被認為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的工具之一。
1. 外源蛋白質(zhì)的基因在甲醇酵母中的高效表達
目前已有多種蛋白質(zhì)的基因在該表達系統(tǒng)中克隆成功,包括蛋白酶、酶抑制劑、受體、單鏈抗體等(表1)。盡管各種外源蛋白質(zhì)產(chǎn)生的水平不一,但各種蛋白質(zhì)在甲醇酵母中的產(chǎn)生水平均為在細菌、昆蟲或哺乳動物等表達系統(tǒng)中產(chǎn)量的10~100倍[2]。如表皮生長因子(EGF)在釀酒酵母中的產(chǎn)量為7.4mg/L,而在甲醇酵母中為450mg/L,提高了60倍[3]。椐報道,外源蛋白質(zhì)在甲醇酵母中的產(chǎn)量最高可達12g/L[9]。

表1 外源蛋白質(zhì)在甲醇酵母中的高效產(chǎn)生

外源蛋白質(zhì) 產(chǎn)生量(g/L) 文獻
轉(zhuǎn)化酶 2.3 [4]
D-丙氨酸羧肽酶 0.8 [5]
α-淀粉酶 2.5 [6]
Kunitz蛋白酶抑制劑(AbPP) 1.0 [7]
瞬時抗凝蛋白(TAP) 1.7 [8]
破傷風(fēng)毒素片段C 12.0 [9]
百日咳抗原P69 3.0 [10]
人免疫缺陷病毒1膜外糖蛋白gp120 1.3 [11]
腫瘤壞死因子(TNF) 10.0 [12]
人轉(zhuǎn)鐵蛋白N端 4.0 [13]

2. 實現(xiàn)外源蛋白質(zhì)高效產(chǎn)生的關(guān)鍵因素
2.1 表達載體 首先,甲醇酵母中沒有穩(wěn)定的質(zhì)粒,所以其表達載體采用整合型質(zhì)粒。利用醇氧化酶(甲醇代謝的關(guān)鍵酶)基因-1(AOX1)的啟動子(PAOX1)和轉(zhuǎn)錄終止子(3′AOX1)構(gòu)建成整合型表達載體。PAOX1是一個極強的啟動子,醇氧化酶的產(chǎn)量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白質(zhì)的30%[2],所以能使外源蛋白質(zhì)在它的控制下高效產(chǎn)生。其次,在載體中加入釀酒酵母的分泌信號和前導(dǎo)肽序列(α因子)構(gòu)建分泌型載體,一方面可以減輕宿主細胞的代謝負荷,另一方面可以減少宿主細胞蛋白水解酶對外源蛋白質(zhì)的降解,pPIC9K、pMETαA、B、C均為此類載體。此外,使多拷貝目的基因整合入甲醇酵母染色體,形成多個表達單元,產(chǎn)生高產(chǎn)的菌株,此類載體有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。
2.2 受體菌 在以葡萄糖或甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長時,甲醇酵母中AOX1基因的表達受到抑制,而在以甲醇為唯一碳源時,誘導(dǎo)基因表達,使外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量更高。甲醇酵母適合高密度連續(xù)培養(yǎng)的條件,細胞干重達100g/L以上,蛋白質(zhì)產(chǎn)量極高[14]。受體菌采用蛋白水解酶缺陷型,從而大大降低產(chǎn)物的降解。常用的甲醇酵母受體菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。?

3. 應(yīng)用前景
經(jīng)過近幾年的發(fā)展完善,甲醇酵母表達系統(tǒng)已日趨成熟,應(yīng)用也日趨廣泛。國內(nèi)已有多篇在甲醇酵母中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)成功的報道(表2)。美國Invitrogen公司也已開發(fā)出多種新型的甲醇酵母表達系統(tǒng)試劑盒,如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等,利用甲醇酵母表達系統(tǒng)克隆一個外源基因已十分方便。相信隨著對甲醇酵母研究的進一步深入,它在生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)方面將日益展示出誘人的前景。

表2 國內(nèi)利用甲醇酵母產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)

外源蛋白質(zhì) 產(chǎn)生量(g/L) 文獻
人胰島素 0.25 [15]
人胰島素原 0.3 [16]
人p53蛋白 0.2 [17]
辣根過氧化物酶 4~6 [18]
人基質(zhì)金屬蛋白酶-9 0.01 [19]

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