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轉(zhuǎn)移電泳技術(shù)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28
(一)原理
轉(zhuǎn)移電泳是將經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出的蛋白質(zhì)譜直接轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,而形成固定相,并同時排除各種干擾物質(zhì),保持其天然構(gòu)象和生物學(xué)活性,完成在凝膠中難以進行的各種生物試驗。
(二)材料
1.瓊脂糖
2.丙烯酰胺
3.甲叉雙丙烯酰胺
4.十二烷基磺酸鈉(SDS)
5.硝酸纖維膜濾紙 孔徑0.45μm
6.瓊脂糖凝膠電泳緩沖液 0.89mMol/L Tris—89mmol/L 硼酸—2.5mMol/L EDTA(pH8.3)。
7.SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液 0.05Mol/L Tris—0.384Mol/L 甘氨酸—0.1%SDS(pH8.3)。
8.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳緩沖液 25mMol/L Tris—192mMol/L 甘氨酸—20%甲醇(pH8.3)。
9.溴乙啶溶液 稱取5mg溴乙啶,用無離子水溶解。定容到10ml,取1ml稀釋到1 000ml,最終濃度為0.5ug/ml。
10.考馬斯亮蘭R-250染色液 0.25%考馬斯亮蘭R-250-10%醋酸-45%甲醇。
11.氨基黑染色液 在含10%醋酸的甲醇中加入氨基黑10B至飽和。
12.垂直板型及水平板型凝膠電泳槽
13.轉(zhuǎn)移電泳槽
14.直流穩(wěn)壓電源0V~800V,0mA~100mA
(三)操作方法
1.SDS—聚丙稀酰胺凝膠電泳(垂直板型)分離蛋白質(zhì)。
⑴凝膠的制備:
丙烯酰胺 15.00g
甲叉雙丙烯酰胺 0.40g
0.37Mol/L Tris—HCl(pH8.3) 50ml
此為丙烯酰胺母液,過濾后4℃保存?zhèn)溆谩?br />丙烯酰胺母液 8.30ml
N、N、N、N—四甲基乙二胺(DEMED) 250ul
10%SDS 0.25ml
0.375Mol/L pH8.8 Tris-HCl 16.45ml
混合即為10%分離膠。
丙烯酰胺母液 1.30ml
TEMED 15.00ul
10%SDS 0.10ml
0.125Mol/L pH6.8Tris-HCl 8.60ml
制成4%濃縮膠。
將分離膠與濃縮膠真空抽氣10min~15min,備用。
⑵凝膠板的制備及加樣:取1%的瓊脂將凝膠膜底部的縫隙封固。在10%的分離膠中加入10%過硫酸銨0.25ml,混勻后,立即沿玻璃壁緩緩加入膠膜中,上端留出5cm的高度,然后用帶有細(xì)針頭的注射器輕輕地向膠面加入蒸餾水,靜置數(shù)分鐘,水膠界面消失,約20min~30min界面清晰(凝膠已聚合),用注射器將水吸出,并用濾紙吸干余水。在4%濃縮膠中加入10%過硫酸銨0.4ml,混勻后,沿玻璃壁緩慢倒入已聚合的分離膠的上面,立即插進樣品槽模板。待凝膠聚合后(約20min~30min),輕輕拔出樣品槽模板。將電泳緩沖液加入上、下電泳槽。
將分離的蛋白質(zhì)樣品用0.01Mol/L Tris-HCl(pH8.0)-0.001Mol/L EDTA-1%SDS-5%硫基乙醇溶液作1︰1稀釋,100℃加熱處理3min之后,加入甘油10%及適當(dāng)量溴酚蘭,用微量注射器將樣品注入樣品槽中,蛋白質(zhì)最后濃度一般為0.05mg/ml~1mg/ml。
⑶電泳:上端接陰極,下端接陽極。電壓120V、電流30mA,電泳時間5h~6h,待染料泳至距底部約1cm處時斷電。
⑷染色:切下一部分凝膠,用考馬斯亮蘭R-250染色作為對照。其余部分作轉(zhuǎn)移電泳。
 
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