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微生物實驗步驟繁多，很容易出錯，奮斗在檢測一線的童鞋們，你遇到過實驗空白板長菌的情況嗎？你又是怎么溯源的呢？是生理鹽水的問題，還是試管的問題，或是平皿的問題，或是環(huán)境的問題......到底該從哪里查起呢？別急，今天小編分享一篇菩提老師的佳作，我們一起來學習一下吧！
空白對照平板上又生長菌落，到底怎么溯源？
一、方法原理：
采用頭腦風暴法（拍腦袋想，紙上談兵）和邏輯學方法進行簡單推理判斷。一邊找污染源，一邊在找的過程中消除掉一些污染源。在順序排除污染源時，可以為下一步做鋪墊，消除掉一些絆腳的可能性，從而排除起來更順暢。查找其他步驟建立良好基礎也是為了最終目的服務，最終目的就是消除所有潛在污染源。這里很佛系的講，找到或沒找到污染源頭都可以，不必太糾結(jié)。
二、建立假設（越詳細越好），還原“案發(fā)現(xiàn)場”。
假設按照GB 4789.2-2022進行菌落總數(shù)計數(shù)，操作過程如下：
（一）、稱樣、均質(zhì)，制備濃度0.1g/mL的樣品勻液B。
超凈臺通風，開著照明燈。點燃酒精燈，在火焰周圍稱樣：稱取樣品A25.0g，入到1L的均質(zhì)袋里，同時把滅菌好的225mL磷酸鹽緩沖溶液，也加入到1L的均質(zhì)袋里，總體積250mL，封口，計為樣品勻液B。
均質(zhì)袋拿出超凈臺，放入桌面上的均質(zhì)器內(nèi)，開啟均質(zhì)器拍打均質(zhì)袋1min。取出均質(zhì)袋，放入超凈臺內(nèi)，放在均質(zhì)袋支架上。
（二）、10倍梯度稀釋法稀釋樣品和制備空白對照。
超凈臺通著風，酒精燈燃著，在火焰周圍開啟均質(zhì)袋口，用1mL移液器裝上吸頭盒里面的1mL規(guī)格的移液器吸頭，開始10倍梯度稀釋。
吸取1mL樣品勻液B（0.1g/mL），加入預先滅菌過的18mm×150mm試管中（裝有滅過菌的9mL磷酸鹽緩沖溶液），得到樣品勻液C（0.01g/mL）。
同理：吸取1mL樣品勻液C，加入預先滅菌過的18mm×150mm試管中（裝有滅過菌的9mL磷酸鹽緩沖溶液），得到樣品勻液D（0.001g/mL）。
...此為10倍梯度稀釋法原理，如果要稀釋n個10倍管（n≥3），按照同理往下即可。暫時認為樣品勻液B、C、D濃度就夠用了。
（三）、傾注平板法制樣品皿和空白對照皿。
預先準備8個滅過菌的空培養(yǎng)皿、1瓶200mL左右的熔化的PCA培養(yǎng)基保溫在水浴48℃中�；靹驑悠穭蛞築、C、D。
分別取1mL樣品勻液B，加入到空白皿1、2，
分別取1mL樣品勻液C，加入到空白皿3、4，
分別取1mL樣品勻液D，加入到空白皿5、6，
分別取1mL磷酸鹽緩沖溶液，加入到空白皿7、8。
傾注PCA培養(yǎng)基至1~8皿，每皿20mL，冷卻、凝固。這樣，裝有樣品的皿分別是皿1、2、3、4、5、6，里面的濃度分別為0.1g/mL,0.01g/mL,0.001g/mL；皿7、8為空白對照皿。
（四）、培養(yǎng)、計數(shù)。
將皿1~8，倒置放入培養(yǎng)箱中，36℃培養(yǎng)48h。菌落計數(shù)。
（五）、發(fā)現(xiàn)空白對照皿中有菌落污染。
假設發(fā)現(xiàn)：1、很多菌，比如幾十個以上。
假設發(fā)現(xiàn)：2、皿7菌落數(shù)0，皿8菌落數(shù)1。意思菌很少。
三、空白污染來源可能性的理論分析：
（一）、要進行溯源性調(diào)查，要了解幾個概念和相互關系。
1.概念：充分條件，必要條件，充要條件。
2.相互關系：
假設A是條件，B是結(jié)論，設C、D分別為A、B所描述對象的集合，則有下列定義和推論：
（1）由A可以推出B，由B可以推出A，則A是B的充分必要條件（此時C等于D）；
（2）由A可以推出B，由B不可以推出A，則A是B的充分不必要條件（此時C包含于D，且不相等）；
（3）由A不可以推出B，由B可以推出A，則A是B的必要不充分條件（此時D包含于C，且不相等）；
（4）由A不可以推出B，由B不可以推出A，則A是B的既不充分也不必要條件（此時C不包含D，D也不包含C）。
（二）、如果（一）中充分條件，必要條件，充要條件相互關系太抽象，想不明白的話，可以參考具體事例進行理解。
例如：空白對照皿中污染（以后簡稱：空白污染）和污染來源之間的關系。
判斷1：假如滅菌鍋滅菌不徹底，那么空白肯定污染（理論上）。
判斷2：假如移液器引入雜菌，那么空白肯定污染（理論上）。
理解1：觀察判斷1和判斷2，我們發(fā)現(xiàn)，只要[滅菌鍋和（/或）移液器]引入污染，都會導致最終空白污染，所以（1）滅菌鍋滅菌不徹底是空白污染的充分條件之一。
理解2：空白污染，不能推出滅菌鍋滅菌不徹底。
因為假設滅菌鍋滅菌徹底，其他環(huán)節(jié)污染，也能導致最終空白長菌。所以（1）滅菌鍋滅菌不徹底是空白污染的非必要條件。
理解3：綜合理解1和理解2，（1）滅菌鍋滅菌不徹底是空白污染的充分非必要條件。
（三）、弄清楚空白污染（結(jié)果）和各個環(huán)境引入雜菌（污染的可能性，條件）之間的關系，我們就可以進行推斷，也就是溯源性調(diào)查。
還有一些隱藏的條件如：空白對照皿中污染的菌不是憑空產(chǎn)生的（因為微生物不會憑空出現(xiàn)），它只會從我們做實驗的操作過程的某一個或多個甚至極端到全部環(huán)節(jié)引入。又因為空白污染的來源很多，某一個污染都只是空白污染的充分非必要條件（一個源引入污染或多個源引入污染，都會導致最終現(xiàn)象-空白污染）。
我們只要把所有的污染來源都查到抓到一起，把所有的污染來源看成一個整體，那么這個整體和空白污染就構(gòu)成了充分必要條件。這其中存在沒有引入污染的，也藏著1個或多個污染來源。我們的目的就是抓到（如果可能）并消除污染來源，使以后不再發(fā)生。
（四）、（三）中提到“我們的目的就是抓到（如果可能）并消除污染來源，使以后不再發(fā)生�！边@里對如果可能進行解釋。
我們溯源調(diào)查采用的是通過假設、重復實驗驗證這樣的一個方法，這是有別于真實發(fā)生了污染的那次實驗，時間和條件都有變化，是一種情景還原模擬。
重復試驗有時候能重復出來，比如設備某一個地方污染，再去檢測還能檢測到菌。
重復試驗有時候不能重復出來，比如檢測員污染那次手上帶了菌，情景再現(xiàn)時，消毒和操作都嚴格了，重復不出來了。所以針對這一現(xiàn)象我們要提醒做重復實驗的人員，讓他盡量還原上一次的情況，不必太認真也不必太放松，越接近上一次的情況模擬效果越好。
重復試驗的可能出現(xiàn)和可能不出現(xiàn)的不確定性，讓我們要我們適當進行變通，由原來找到污染來源并消除，改成努力尋找污染來源，如果抓不到，退而求其次，只要能消除污染來源，通過后續(xù)驗證，發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象不在出現(xiàn)，也可以認為達到了溯源調(diào)查的目的。
這個地方一定要想通，否則可能造成一種高尚的自虐行為。這一點要特別提醒檢測員，是因為我們特殊的職業(yè)習慣（趨近完面和強迫癥），檢測人員越嚴謹認真，有時候容易鉆牛角尖，找不到污染來源時，可能被嚴謹和認真“反噬”，走火入魔，吃不好睡不好，整個人都不好了。
四、頭腦風暴法列出可能的污染來源：
回看 “二、假設條件（越詳細越好）”寫各種設備及操作過程較為詳細，這一點在溯源性調(diào)查中非常重要。我們要建立機制尋找較為全面的污染來源。
作為微生物單一菌體肉眼不可見的特點，污染的來源藏在每一個細節(jié)里，所以進行頭腦風暴時，一定要觀察入微，調(diào)查仔細，不放過任何的可能性，簡單的思想就是：懷疑一切。
如果想象力不很強大的人，平時可以多練習冥想，提高自己想象力。也可以通過回憶檢測過程、紙上談兵模擬推演檢測過程來幫助我們還原一個近似真實的“案發(fā)現(xiàn)場”。
簡單風暴如下（因為每個人的操作習慣及每一次偶然事件形成的特殊性，每個人要根據(jù)自己的情況進行仔細進行）：我們按檢測過程進行規(guī)律性的瞎猜。
1.滅菌鍋：
1.1、滅菌不徹底，滅完還有菌活的；
1.2、其他一切詭異的只有想不到?jīng)]有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在。
2.超凈臺：
2.1超凈臺過濾效力下降，風中帶菌。
2.2其他一切詭異的只有想不到?jīng)]有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在。
3.超凈臺內(nèi)部操作不當：
3.1沒開風。
3.2風力太小，亂流。
3.3超凈臺沒擦拭，環(huán)境惡劣。
3.4操作過程中離酒精燈遠。
3.5操作過程移液器帶菌污染。
3.6操作過程中拿進拿出樣品污染影響了環(huán)境造成污染。
3.7人帶進去菌污染。
3.8其他一切詭異的只有想不到?jīng)]有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在。
4.培養(yǎng)箱內(nèi)造成的污染。
4.1風太大，吹進去。
4.2皿太濕，菌爬進去。
4.3培養(yǎng)箱環(huán)境惡劣，只要進去就有菌污染的小概率奇跡事件存在。
4.4其他一切詭異的只有想不到?jīng)]有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在。
5.其他：
5.1槍頭不新鮮。
5.2槍頭盒不新鮮。
5.3皿滅完濕漉漉的沒吹干，菌爬進去了。
5.4其他一切詭異的只有想不到?jīng)]有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在
五、污染源調(diào)查要充分考慮順序性：
做事有序，處理事情就顯得簡單，大腦處理起來也愉悅，同樣溯源性調(diào)查時，充分利用分類學，真相會相對容易發(fā)現(xiàn)。
所以枚舉時，要充分考慮順序性。盡可能分塊進行頭腦風暴，一方面不容易漏掉，一方面也有利于我們回頭檢查自己是否漏掉了一些細節(jié)性的部分，化整為零，逐一擊破。相反，雜亂無章的亂想是不科學的，擾亂了自己的心緒，也容易漏掉一些可能性。
另外，順序條理的想問題，就把隨機性變成了一種特殊性，更好找規(guī)律。這在消除時也有幫助。
六、提出消除污染來源的試驗方案：
經(jīng)過充分、有序的找到污染來源后。我們可以按從流程的源頭往后重新重復試驗和排查。采用排除法。
我們做微生物實驗最重要的概念之一“無菌概念”。也許無菌概念太抽象，那么我們反過來，提出“有菌概念”。意思整個環(huán)境都是有菌的，這就是有菌概念。那么要想獲取無菌的環(huán)境，只有在有菌的環(huán)境中撕開一個口子，制造無菌環(huán)境。
（一）首先，起點定在滅菌鍋這里（如果煮沸的培養(yǎng)基就不是這里了，沒說盡的事情自己靈活掌握），滅菌鍋是“潔凈之源”，重復滅菌看滅菌鍋滅菌充分不充分，由于滅菌后驗證單獨不好執(zhí)行。就考慮和培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基聯(lián)系在一起進行捆綁驗證。意思就是沒有污染就都算合格，有污染再分別調(diào)查看是哪個污染。
同時重復實驗時考慮培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基、移液器吸頭等是否有引入污染的可能性，都通過重復實驗和簡單對比進行。
具體操作：準備100mL的三角瓶，每瓶配30mL的固體培養(yǎng)基，如此配10瓶，放在滅菌鍋的不同位置和層之間，按照之前的滅菌方式滅菌（不要過嚴也不要放松，目的是盡可能的還原污染時候滅菌的情況）進行滅菌，滅菌后凝固了直接放培養(yǎng)箱里面36℃培養(yǎng)48h。
（二）滅菌鍋滅菌不徹底和培養(yǎng)箱的污染可能性的排查。
培養(yǎng)后觀察結(jié)果，再沒有看到皿時，會有2種可能：沒長菌和長菌。
1.沒長菌。
認為培養(yǎng)箱、滅菌鍋是沒有污染的，繼續(xù)下一步調(diào)查。如果對一次試驗不放心，可以重復此實驗3~5次，都沒有問題則認為這步驟無污染。
2長菌。
認為滅菌鍋、培養(yǎng)箱之間至少一個環(huán)節(jié)造成污染，為了區(qū)別是滅菌不充分還是培養(yǎng)過程進去的，滅完菌后讓三角瓶適當干燥后，直接室溫放置（培養(yǎng)）48h，從而可以區(qū)分。另外需要注意的是，如果瓶子培養(yǎng)基菌很多，表面、內(nèi)部都有，那么可以認為是滅菌不徹底，因為一方面環(huán)境空氣中要進入三角瓶不容易（有封口膜封口），就算進入數(shù)量也少，要進入培養(yǎng)基內(nèi)部可能性幾乎不可能，所以這時候重點就放在驗證滅菌鍋滅菌效果上，比如使用生物指示劑驗證。
（三）滅菌鍋已確認污染來源情況并進行了消除后，開展超凈臺內(nèi)污染可能性的排查。
針對“2.1超凈臺過濾效力下降，風中帶菌”，做沉降菌試驗，看看吹出來的風是不是有污染。這時候順序排查的優(yōu)勢就出來了，只有鍋好的，培養(yǎng)基滅完是無菌的，沉降菌出現(xiàn)菌才能說明排風有問題，當然同時要注意排除人的污染性。
做沉降之前，超凈臺可以進行一次擦拭和清潔，這樣如果沒有污染了也好，因為我們找到或找不到污染源都不要緊，重要的是以后不再出現(xiàn)這個污染的現(xiàn)象。
針對“超凈臺內(nèi)部操作不當”的原因，要考慮人為原因，要建立無菌概念，以及可以幾個人一起操作或進行外部培訓等，消除個人操作的一些陋習。從而達到反復實驗也不污染，才能上崗，總之微生物基礎還需要加強。
超凈臺沒問題了，就去考慮培養(yǎng)箱的問題。
七、總結(jié)一下污染物溯源調(diào)查的思路：
污染物溯源調(diào)查沒有定法，腦子要活絡，一方面要非常熟悉檢測流程和建立關鍵控制點，同時要充分考慮被污染的每一個環(huán)節(jié)，前后推敲，找出盡可能多的污染來源。在設想污染可能性的起始階段，要放下“我沒有做錯，我沒污染”的思想包袱，要懷疑一切，假設每個細節(jié)都有污染，我們通過試驗去證明是否有污染，因為實踐是檢驗真理的唯一標準，真理沒有經(jīng)過實踐驗證，都可能是謬誤。這是建立在我們唯物主義價值觀以及認為世界是客觀存在、以及客觀存在是正確的統(tǒng)一認識基礎上的（這個認識從牛頓時代才建立的）。
理出一個排除的思路，盡量按照順序、分塊、化整為零的方式進行，充分考慮各種可能性之間的如關聯(lián)、排他等內(nèi)在邏輯關系。排除過程中嚴謹推斷，不能遺漏。
同時還要考慮主觀能動性，有些地方單一搞不了，那就分分合合，怎么方便怎么能達到最終消除污染就行。
這樣一步一步走下去，最終找到真相，從而消除空白污染。
