有色溶液對(duì)光線有選擇性的吸收作用，不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，對(duì)不同波長(zhǎng)線的吸收能力也不同，因此，每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光譜。有些無色溶液，光雖對(duì)可見光無吸收作光光度技術(shù)吸收用，但所含物質(zhì)可以吸收特定波長(zhǎng)的紫外線或紅外線。分光譜來鑒定物質(zhì)性質(zhì)及含量的技術(shù)，其理論依據(jù)是（分光光度法）主要是指利用物質(zhì)特有的Lambert和Beer定律。
分光光度法是比色法的發(fā)展。比色法只限于在可見光區(qū)，分光光度法則可以擴(kuò)展到紫外光區(qū)和紅外光區(qū)。比色法用的單色光是來自濾光片，譜帶寬度從40-120nm,精度不高，分光光度法則要求近于真正單色光，其光譜帶寬最大不超過3-5nm,在紫外區(qū)可到1nm以下，來自棱鏡或光柵，具有較高的精度。

基本原理

一、光的基本知識(shí)
光是由光量子組成的，具有二重性，即不連續(xù)的微粒和連續(xù)的波動(dòng)性。波長(zhǎng)和頻率是光的波動(dòng)性和特征，可用下式表示：
式中λ為波長(zhǎng)，具有相同的振動(dòng)相位的相鄰兩點(diǎn)間的距離叫波長(zhǎng)。V為頻率，即每秒鐘振動(dòng)次數(shù)。C為光速等于299770千米/秒。光屬于電磁波。自然界中存在各種不同波長(zhǎng)的電磁波，列成表1-1所示的波譜圖。 分光光度法所使用的光譜范圍在200nm-10μ（1μ= 1, 000nm ）之間。其中200nm-400nm為紫外光區(qū)，400nm-760nm為可見光區(qū)，760nm-10,000nm為紅外光區(qū)。
二、朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律
朗伯-比爾定律是比色分析的基本原理，這個(gè)定律是有色溶液對(duì)單色光的吸收程度與溶液及液層厚度間的定量關(guān)系。此定律是由朗伯定律和比爾定律歸納而得。
1.朗伯定律
一束單色光通過溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的強(qiáng)度就要減弱：若溶液濃度不變，則溶液的厚度愈大（即光在溶液中所經(jīng)過的途徑愈長(zhǎng)），光的強(qiáng)度減低也愈顯著。
2.朗伯-比爾定律
如果同時(shí)考慮吸收層的厚度和溶液濃度對(duì)光吸收的影響，則必然將朗伯定律和比爾定律合并起來，吸光度與溶液的濃度和液層的厚度的乘積成正比，這就是朗伯-比爾定律。

分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介

能從含有各種波長(zhǎng)的混合光中將每一單色光分離出來并測(cè)量其強(qiáng)度的儀器稱為分光光度計(jì)。
分光光度計(jì)因使用的波長(zhǎng)范圍不同而分為紫外光區(qū)、可見光區(qū)、紅外光區(qū)以及萬用（全波段）分光光度計(jì)等。無論哪一類分光光度計(jì)都由下列五部分組成，即光源、單色器、狹縫、樣品池，檢測(cè)器系統(tǒng)。
一、光源
要求能提供所需波長(zhǎng)范圍的連續(xù)光譜，穩(wěn)定而有足夠的強(qiáng)度。常用的有白熾燈（鎢比燈、鹵鎢燈等），氣體放電燈（氫燈、氘燈及氙燈等），金屬弧燈（各種汞燈）等多種。
鎢燈和鹵鎢燈發(fā)射320-2000nm連續(xù)光譜，最適宜工作范圍為360-1000nm,穩(wěn)定性好，用作可見光分光光度計(jì)的光源。氫燈和氘燈能發(fā)射150-400nm的紫外結(jié)，可用作紫外光區(qū)分光光度計(jì)的光源。紅外線光源則由納恩斯特（Nernst）棒產(chǎn)生，此棒由ZrO2:Y2O3=17:3（Zr為鋯，Y為釔）或Y2O3,GeO2（Ge為鈰）及ThO2（Th為釷）之混合物制成。汞燈發(fā)射的不是連續(xù)光譜， 能量絕大部分集中在253.6nm波長(zhǎng)外，一般作波長(zhǎng)校正用。鎢燈在出現(xiàn)燈管發(fā)黑時(shí)應(yīng)及更換，如換用的燈型號(hào)不同，還需要調(diào)節(jié)燈座的位置的焦距。氫粘及氘燈的燈管或窗口是石英的，且有固定的發(fā)射方向，安裝時(shí)必須仔細(xì)校正接觸燈管時(shí)應(yīng)戴手套以防留下污跡。
二、分光系統(tǒng)（單色器）
單色器是指能從混合光波中分解出來所需單一波長(zhǎng)光的裝置，由棱鏡或光柵構(gòu)成。用玻璃制成的棱鏡色散力強(qiáng)，但只能在可見光區(qū)工作，石棱鏡工作波長(zhǎng)范圍為185-4000nm,在紫外區(qū)有較好的分辯力而且也適用于可見光區(qū)和近紅外區(qū)。 棱鏡的特點(diǎn)是波長(zhǎng)越短，色散程度越好，越向長(zhǎng)波一側(cè)越差。所以用棱鏡的分光光度計(jì)，其波長(zhǎng)刻度在紫外區(qū)可達(dá)到0.2nm,而在長(zhǎng)波段只能達(dá)到5nm.有的分光光系統(tǒng)是衍射光柵，即在石英或玻璃的表面上刻劃許多平行線，刻線處不透光，于是通過光的干涉和衍射現(xiàn)象，較長(zhǎng)的光波偏折的角度大，較短的光波偏折的角度小，因而形成光譜。
三、狹縫
狹縫是指由一對(duì)隔板在光通路上形成的縫隙，用來調(diào)節(jié)入射單色光的純度和強(qiáng)度，也直接影響分辯力。狹縫可在0-2mm寬度內(nèi)調(diào)節(jié)，由于棱鏡色散力隨波長(zhǎng)不同而變化，較先進(jìn)的分光光度計(jì)的狹縫寬度可隨波長(zhǎng)一起調(diào)節(jié)。
四、比色環(huán)
比爭(zhēng)環(huán)也叫樣品池，吸收器或比色皿，用來盛溶液，各個(gè)杯子壁厚度等規(guī)格應(yīng)盡可能完全相等，否則將產(chǎn)生測(cè)定誤差。玻璃比色杯只適用于可見光區(qū)，在紫外區(qū)測(cè)定時(shí)要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的光學(xué)面，用后要及時(shí)洗滌，可用溫水或稀鹽酸，乙醇以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。
五、檢測(cè)器系統(tǒng)
有許多金屬能在光的照射下產(chǎn)生電流，光愈強(qiáng)電流愈大，此即光電效應(yīng)。因光照射而產(chǎn)生的電流叫做光電流。受光器有兩種，一是光電池，二是光電管。光電池的組成種類繁多，最常見的是硒光電池。光電池受光照射產(chǎn)生的電流頗大，可直接用微電流計(jì)量出。但是，當(dāng)連續(xù)照射一段時(shí)間會(huì)產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象而使光電流下降，要在暗中放置一些時(shí)候才能恢復(fù)。因此使用時(shí)不宜長(zhǎng)期照射，隨用隨關(guān)，以防止光電池因疲勞而產(chǎn)生誤差。
光電管裝有一個(gè)陰極和一個(gè)陽(yáng)極，陰極是用對(duì)光敏感的金屬（多為堿土金屬的氧化物）做成，當(dāng)光射到陰極且達(dá)到一定能量時(shí)，金屬原子中電子發(fā)射出來。光愈強(qiáng)，光波的振幅愈大，電子放出愈多。電子是帶負(fù)電的，被吸引到陽(yáng)極上而產(chǎn)生電流。光電管產(chǎn)生電流很小，需要放大。分光光度計(jì)中常用電子倍增光電管，在光照射下所產(chǎn)生的電流比其他光電管要大得多，這就提高了測(cè)定的靈敏度。
檢測(cè)器產(chǎn)生的光電流以某種方式轉(zhuǎn)變成模擬的或數(shù)字的結(jié)果，模擬輸出裝置包括電流表、電壓表、記錄器、示波器及與計(jì)算機(jī)聯(lián)用等，數(shù)字輸出則通過模擬/數(shù)字轉(zhuǎn)換裝置如數(shù)字式電壓表等。

分光光度技術(shù)的應(yīng)用

一、測(cè)定溶液中物質(zhì)的含量
可見或紫外分光光度法都可用于測(cè)定溶液中物質(zhì)的含量。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度已知的溶液）和未知液（濃度待測(cè)定的溶液）的吸光度，進(jìn)行比較，由于所用吸收池的厚度是一樣的。也可以先測(cè)出不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在選定的濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該是一條直線，然后測(cè)定出未知液的吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到其相對(duì)應(yīng)的濃度。
含量測(cè)定時(shí)所用波長(zhǎng)通常要選擇被測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)，這樣做有兩個(gè)好處：
⑴靈敏度大，物質(zhì)在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異；
⑵可以避免其它物質(zhì)的干擾。
二、用紫外光譜鑒定化合物
使用分光光度計(jì)可以繪制吸收光譜曲線。方法是用各種波長(zhǎng)不同的單色光分別通過某一濃度的溶液，測(cè)定此溶液對(duì)每一種單色光的吸光度，然后以波長(zhǎng)為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)繪制吸光度──波長(zhǎng)曲線，此曲線即吸收光譜曲線。各種物質(zhì)有它自己一定的吸收光譜曲線，因此用吸收光譜曲線圖可以進(jìn)行物質(zhì)種類的鑒定。當(dāng)一種未知物質(zhì)的吸收光譜曲線和某一已知物質(zhì)的吸收光譜曲線開關(guān)一樣時(shí)，則很可能它們是同一物質(zhì)。一定物質(zhì)在不同濃度時(shí)，其吸收光譜曲線中，峰值的大小不同，但形狀相似，即吸收高峰和低峰的波長(zhǎng)是一定不變的。紫外線吸收是由不飽和的結(jié)構(gòu)造成的，含有雙鍵的化合物表現(xiàn)出吸收峰。紫外吸收光譜比較簡(jiǎn)單，同一種物質(zhì)的紫外吸收光譜應(yīng)完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結(jié)構(gòu)不一定相同。除了特殊情況外，單獨(dú)依靠紫外吸收光譜決定一個(gè)未知物結(jié)構(gòu)，必須與其它方法配合。紫外吸收光譜分析主要用于已知物質(zhì)的定量分析和純度分析。