RT-qPCR 是一種用于實時擴(kuò)增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針,當(dāng)與擴(kuò)增的 DNA 或 RNA 分子結(jié)合時會發(fā)出信號,從而可以對目標(biāo)序列進(jìn)行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達(dá)分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應(yīng)用。
RT-qPCR原理的三個主要步驟:
1 反轉(zhuǎn)錄:
· 使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
· 該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴(kuò)增的DNA形式。
· 反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物。
2 PCR擴(kuò)增:
· 使用特定引物對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,這些引物環(huán)繞目標(biāo)區(qū)域。
· PCR是一個循環(huán)過程,呈指數(shù)級擴(kuò)增DNA模板的數(shù)量。
· PCR反應(yīng)中包含熒光染料或探針,它們結(jié)合到擴(kuò)增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號。
3 熒光實時檢測:
· 使用實時PCR儀器實時監(jiān)測熒光信號。
· 熒光的數(shù)量與每個PCR循環(huán)中擴(kuò)增的DNA數(shù)量成比例。
· 使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值(Ct)值,該值表示熒光信號達(dá)到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù)。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標(biāo)DNA量,從而允許進(jìn)行基因表達(dá)或病毒載量等定量分析。
實驗步驟:
一、RNA提取:
RNA的提取是參照全式金生物的Transzol up提取試劑盒完成的。
1、離心機(jī)4℃預(yù)冷,準(zhǔn)備試劑:氯仿、異內(nèi)醇、75%乙醇(用DEPC水配制)、無RNase的水或DEPC水、無酶吸頭及試管,戴口罩、帽子、無粉乳膠手套;
2、取出轉(zhuǎn)染建模成功24h后的細(xì)胞,吸棄培養(yǎng)液,用1×PBS清洗1次;
3、每10cm2生長的細(xì)胞加入1mL的Transzol Up, 放置片刻后使用移液槍吹打細(xì)胞使其全脫落;
4、用移液槍反復(fù)吹吸裂解液直至無明顯沉淀,將裂解液全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)記好的1.5mL EP管中,室溫靜置5min;
5、往每個EP管中加0.2mL氯仿(Transzol Up體積的1/5),混勻振蕩30s,室溫靜置3min;
6、4℃條件下10000g離心15min,離心后RNA主要分布在上層水相中,體積約50%;
7、轉(zhuǎn)移上層水相于新的EP管中(約400μL,注意不要吸取到下層),每管加入0.5mL異丙醇 (Transzol Up體積的1/2),顛倒混勻,室溫孵育10min;
8、4℃下10000g離心10min后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀,吸棄上清,加1mL 75%乙醇吹懸沉淀;
9、4℃下7500g離心5min后棄上清,盡量吸凈,室溫晾干沉淀5min,依細(xì)胞量加入30~100μL的RNA溶解液;
10、55℃~60℃金屬浴10min,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>
二、cDNA合成
三、qPCR:
在ABI熒光定量PCR儀專用96孔板中建立qPCR反應(yīng)體系,反應(yīng)程序為兩步法。
4、RT-qPCR統(tǒng)計:每個基因在不同組別中的表達(dá)在獲得3個重復(fù)的Ct值后,從ABI系統(tǒng)中拷貝原始數(shù)據(jù),挑出“Ct SD”值大于0.5的組別(需重新實驗),求出各個組的管家基因GAPDH的均值(一般相差1個Ct值以內(nèi)),再依次求出實驗組和對照組與各自的GAPDH之間的Ct差值,即得到第一個ΔCt,隨后求出實驗組ΔCt和對照組ΔCt的差值,即可得到第二個ΔCt(ΔΔCt),最后使用2 -ΔΔCt法求出實驗組相對于對照組的Ct值變化倍數(shù)(實驗組2 -ΔΔCt/對照組2 -ΔΔCt=實驗組2 -ΔΔCt/2 0=實驗組2 -ΔΔCt)。將3組實驗組數(shù)據(jù)導(dǎo)入Graphpad 9.0,輸入對照組數(shù)據(jù)為1,使用Student's t或ANOVA進(jìn)行假設(shè)檢驗,p<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。