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培養(yǎng)基的制備、使用、保存及相關(guān)疑難解答

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2019-06-28
核心提示:01培養(yǎng)基的實驗室制備確制備培養(yǎng)基時微生物檢驗的最基礎(chǔ)步驟之一。使用脫水培養(yǎng)基和其他成分,尤其是含有有毒物質(zhì)(如膽鹽或其他選
 

01

培養(yǎng)基的實驗室制備



確制備培養(yǎng)基時微生物檢驗的最基礎(chǔ)步驟之一。使用脫水培養(yǎng)基和其他成分,尤其是含有有毒物質(zhì)(如膽鹽或其他選擇劑)的成分時,應(yīng)遵守良好實驗室規(guī)范和生產(chǎn)廠商提供的使用說明。培養(yǎng)基的不正確制備會導(dǎo)致培養(yǎng)基出現(xiàn)質(zhì)量問題。


使用商品化脫水合成培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基時,應(yīng)嚴(yán)格按照廠商提供的使用說明配置。記錄所有相關(guān)數(shù)據(jù),如質(zhì)量/體積、pH、制備日期、滅菌條件和制備人員等。


使用各別成分制備培養(yǎng)基時,應(yīng)按照配方準(zhǔn)確配制,記錄所有細節(jié)信息,如;培養(yǎng)基名稱和類型及試劑級別、每個成分物質(zhì)含量、制造商、批號、pH、培養(yǎng)基體積(分裝體積)、無菌措施(包括實施的方式、溫度及時間)、配置日期、人員等,以便潮源。

 


1.水


除特定要求,實驗室用水的電導(dǎo)率在25℃下應(yīng)不高于25uS/cm(相當(dāng)于電阻率≥0.4MΩcm)。

微生物污染應(yīng)不超過
103CFU/mL,最好低于102CFU/mL。應(yīng)根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期檢驗微生物的污染。

 


2.稱量和復(fù)水


稱量所需量的脫水培養(yǎng)基(注意防止吸入粉末,尤其是含有有害物質(zhì)的培養(yǎng)基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培養(yǎng)基結(jié)塊)后再加水至所需的量。

 


3.溶解和分裝


脫水培養(yǎng)基加水后適當(dāng)加熱,并不攪拌使其快速溶解,必要時,重新溶解。含瓊脂的培養(yǎng)基在加熱溶解前應(yīng)浸泡幾分鐘。

 


4.pH的測定和調(diào)整


用pH計測定pH,必要時在滅菌前調(diào)節(jié)pH,除特殊說明外,培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25℃時,要求pH的變化不超過0.2pH單位.通常使用濃度約為40g/L( 約1 mol/ L)的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L(約1mol/L)的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH。如果滅菌后調(diào)節(jié)pH,溶液需滅菌。


注:商品化培養(yǎng)基在高壓滅菌前后pH可能發(fā)生明顯變化,但使用蒸餾水或去離子水時,滅菌前無需調(diào)節(jié)pH。

 


5.分裝


將配置好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)?shù)娜萜髦,容器的體積至少為體積的1.2倍。

 


6.滅菌


①概述

培養(yǎng)基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過濾滅菌。

有些培養(yǎng)基無需高壓滅菌,可煮滅菌。如,含亮綠的腸道菌培養(yǎng)基對光和熱特別敏感,應(yīng)在煮沸后快速冷卻,避光保存。同樣,一些試劑則不需要滅菌,直接使用(參見相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或生產(chǎn)廠商的使用說明)。

 


②濕熱滅菌

濕熱滅菌在高壓鍋或培養(yǎng)基制備器中進行。高壓霉菌一般采用121℃±3℃霉菌15min。如果培養(yǎng)基的體積超過1000mL,要對滅菌條件進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。所有操作均要按照標(biāo)準(zhǔn)和使用說明的規(guī)定進行。


注:大容量培養(yǎng)基(>1000mL)滅菌時可能會造成過度加熱。

加熱后應(yīng)采取適當(dāng)?shù)姆绞嚼鋮s,防止沸溢。這對大容量培養(yǎng)基和敏感性培養(yǎng)基(如含亮綠的培養(yǎng)基)是非常重要的。


③過濾滅菌


過濾滅菌可以在真空負(fù)壓或正壓條件下進行。使用無菌設(shè)備和0.2um孔徑的濾膜。將過濾裝置的各個部分消毒滅菌,或使用預(yù)消毒設(shè)備。


一些濾膜上附著蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)(如抗生素)。為達到有效過濾,應(yīng)事先將濾膜用無菌水潤濕。


④監(jiān)測


應(yīng)對經(jīng)濕熱或過濾滅菌的培養(yǎng)基進行監(jiān)測,尤其要對pH、色澤、滅菌效果和均勻度等指標(biāo)進行監(jiān)測。

 


7.添加劑的制備


制備含有有毒物質(zhì)(特別是抗生素)時應(yīng)小心操作,避免因粉末的擴散造成實驗人員過敏或發(fā)生其他不良反應(yīng)。采用適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施并小心按照產(chǎn)品使用說明操作。不要使用過期的試劑;抗生素工作溶液現(xiàn)配現(xiàn)用;批量配置的抗生素溶液分裝后向冷凍保存,但解凍后的貯存溶液不可再次冷凍;廠商應(yīng)提供冷凍對抗生素活性影響的相關(guān)資料,也可由使用者自行測定。

 

02

培養(yǎng)基的使用


1.瓊脂培養(yǎng)基的融化


將培養(yǎng)基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法(如高壓鍋中的蒸汽)融化。經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)基盡量減少重新加熱的時間,避免過度加熱。培養(yǎng)基融化后立即移開,室溫靜置片刻(約2min),以免玻璃容器發(fā)生破裂。


融化后的培養(yǎng)基放入47℃~50℃恒溫水浴鍋中保溫,冷卻到47℃~50℃所需的時間取決于培養(yǎng)基的類型、體積和在水鍋里的分裝量。融化后內(nèi)培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用,放置時間一般不超過4h。剩余的培養(yǎng)基固后不得再次融化使用。特別是靈敏性培養(yǎng)基,應(yīng)根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),縮短融化后放置的時間。


將瓊脂培養(yǎng)基倒入類似檢測培養(yǎng)使用的獨立容器中,插入溫度計,記錄并保存瓊脂的融化溫度。


加入樣品的培養(yǎng)基應(yīng)將溫度調(diào)節(jié)到44℃~47℃,或按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)溫度。

 


2.培養(yǎng)基的脫氣


必要時,在使用前將養(yǎng)基放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min,加熱時松開容器蓋子;加熱后蓋緊蓋子,并迅速冷卻至使用溫度。

 


3.添加成分的加入


對熱不穩(wěn)定的添加成分應(yīng)在培養(yǎng)基冷卻至47℃~50℃時加入,滅菌的添加成分加入前應(yīng)冷卻至室溫,避免冷的液體會造成瓊脂凝膠或形成片狀物。將添加成分慢加入培養(yǎng)基并充分混勻,盡快分裝到待用的容器中。

 


4.培養(yǎng)基的棄置


所有污染和未使用的培養(yǎng)基的棄置應(yīng)采用安全的方式,并符合相關(guān)法律法規(guī)的規(guī)定。

 

 

03

 

平板的制備和儲存

 


傾注融化后的培養(yǎng)基到平皿中,使之在乎皿中形成一個至少3mm厚度的瓊脂層(直經(jīng)90mm的平皿通常要加入18mL-20mL瓊脂培養(yǎng)基),或根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求制備平皿。將平皿蓋好皿蓋后放置在水平平面使指冷卻凝固。如果平板要儲存、培養(yǎng)時間超過48h或培養(yǎng)溫度超過40℃,要增加培養(yǎng)基的傾注量。


注:在培養(yǎng)過程中,瓊脂培養(yǎng)基會損失水分,在某些環(huán)境條件下會影響微生物的生長。,造成培養(yǎng)基水分損失的因素很多,如培養(yǎng)基的成分、平皿中培養(yǎng)基的量、培養(yǎng)箱的類型(如使用帶風(fēng)扇的培養(yǎng)箱)、培養(yǎng)箱里的空氣濕度、平皿在培養(yǎng)箱中放置的位置和數(shù)量以及培養(yǎng)溫度等。


凝固后的培養(yǎng)基應(yīng)立即使用或存放在防止其成分發(fā)生變化的條件下,如存放于暗處和(或)5℃±3℃冰箱的密封袋中。在平板的底部或側(cè)面做好標(biāo)記,標(biāo)記的內(nèi)容包括培養(yǎng)基名稱、制備日期和(或)有效期,也可使用適宜的培養(yǎng)基編碼系統(tǒng)進行標(biāo)記。


將傾注好的平板放在密封袋中冷蔵可延長儲存期限。為了避免冷凝水的產(chǎn)生,平板應(yīng)冷卻后再裝入密封袋中。貯存前不要對培養(yǎng)基表面進行干燥處理。


對于采用表面接種的固體培養(yǎng)基,應(yīng)先對瓊脂表面進行干燥:揭開平皿蓋,將平板倒扣于烘箱/培養(yǎng)箱中(溫度設(shè)置為25℃~50℃);或放在有對流風(fēng)的無菌凈化臺中,直到培養(yǎng)基表面的水滴消失為止。注意不要過度干燥。商業(yè)化的平板脂培養(yǎng)基應(yīng)按照廠商提供的說明使用。

 

 

04

疑難解答


1.培養(yǎng)基不能凝固  
                                            


①培養(yǎng)基制備過程中過度加熱


②低pH值造成培養(yǎng)基酸解


③瓊脂使用量不正確                                           


④瓊脂未完全溶解                                             


⑤培養(yǎng)基成分未充分混勻  
                                                                                               


2.pH值不正確  
                                                 


①培養(yǎng)基制備過程中過度加熱


②水質(zhì)不佳                                                 


③外部化學(xué)物質(zhì)污染


④在不正確溫度下測量pH值


⑤pH計未正確校準(zhǔn)                                           


⑥脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差   
                                                                                                     


3.顏色異常        
                                                


①培養(yǎng)基制備過程中過度加熱


②水質(zhì)不佳                                               


③脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差                                          


④pH值不正確                                                   


⑤外來污染     
                                                                                                         


4.產(chǎn)生沉淀  
                                                    


①培養(yǎng)基制備過程中過度加熱


②水質(zhì)不佳                                                 


③脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差


④pH值未正確控制


⑤如果是各別成分制備的培養(yǎng)基---原材料不純                                                                   
                   


5.培養(yǎng)基出現(xiàn)抑制/生長率低


①培養(yǎng)基制備過程中過度加熱


②水質(zhì)不佳                                                


③脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差                                         


④配方使用不對                                                   


⑤添加成分不正確,如加入添加成分時培養(yǎng)基過熱或添加濃度錯誤       


⑥添加物被污染                                                                    
                


6.污染   
                                                  


①滅菌不充分                                               


②無菌操作有誤                                                   


③添加物被污染
         


編輯:songjiajie2010

 
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