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水體中大腸菌群的檢測(cè)步驟

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2019-09-16
核心提示:實(shí)驗(yàn)原理所謂大腸菌群,是指在37℃培養(yǎng)24h 內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革藍(lán)氏陰性無芽孢桿菌的總稱。主要由腸桿菌科中四
實(shí)驗(yàn)原理

所謂大腸菌群,是指在37℃培養(yǎng)24h 內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革藍(lán)氏陰性無芽孢桿菌的總稱。主要由腸桿菌科中四個(gè)屬內(nèi)的細(xì)菌組成,即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。

水的大腸菌群數(shù)是指100 mL水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實(shí)際數(shù)值,以大腸菌群最近似數(shù)(MPN)表示。在正常情況下,腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽孢桿菌等多種細(xì)菌。這些細(xì)菌都可以隨人畜排泄物進(jìn)入水源,由于大腸菌群在腸道內(nèi)數(shù)量多,所以,水源中大腸菌群的數(shù)量,是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項(xiàng)重要指標(biāo)。目前,國際上已公認(rèn)大腸菌群是糞便污染的指標(biāo)。因而對(duì)飲用水必須進(jìn)行大腸菌群的檢查。

水中大腸菌群的檢測(cè)方法,常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可適用于各種水樣的檢驗(yàn),但操作繁瑣,需要的時(shí)間較長。濾膜法僅適用于自來水和深井水,操作簡(jiǎn)單、快速,但不適用于雜質(zhì)較多、易于堵塞濾孔的水樣。

材料與器皿

(—)培養(yǎng)基

1、普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

蛋白胨 10g,牛肉膏 3g,乳糖5g,氯化鈉 5g,1.6%溴甲酚紫乙醇液 1.0mL,蒸餾水 1000mL,pH 7.2~7.4。

將蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH為7.2~7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇液1.0mL,充分混勻,分裝于有杜漢氏小管的試管中,每管10mL,115℃滅菌20min。

2、三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

按上述普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制,分裝于有杜漢氏小管的試管中,每管5mL。

3、品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基(供平板分離用)

蛋白胨 10g, 乳糖 10g,K2HPO4 3.5g,瓊脂 15-20g,蒸餾水1000mL,無水亞硫酸鈉 5g,5%的堿性品紅乙醇溶液 20mL,pH 7.2~7.4。

4、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(EMB培養(yǎng)基)(供發(fā)酵法平板分離用,3和4可任選一種)

蛋白胨10g,乳糖10g,K2HPO4 2.0g,瓊脂20g,蒸餾水1000mL,2%伊紅(曙紅)水溶液 20mL,5%美藍(lán)(亞甲藍(lán))水溶液13mL,pH 7.2~7.4。


(二)滅菌移液管、滅菌稀釋水、試管、杜漢氏小管、革蘭氏染色液、滅菌培養(yǎng)皿。


實(shí)驗(yàn)過程


(一)水樣的采集

供細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的水樣,必須按一般無菌操作的基本要求采集,并保證再運(yùn)送、貯存過程中不受污染。水樣從采集到檢驗(yàn)不應(yīng)超過4h ,在0-4℃下保存不應(yīng)超過24h ,如不能在4h內(nèi)分析,應(yīng)在檢驗(yàn)報(bào)告上注明保存時(shí)間和條件。

1、自來水取樣:應(yīng)在水龍頭打開放水5min,再用無菌容器接取水樣,待分析。如水樣內(nèi)含有余氯,則采樣瓶滅菌后按每500mL水樣加3% Na2S2O3.5H2O溶液1mL。

2、江、河、湖、池自然水體取樣:可用采樣器,采樣瓶應(yīng)先滅菌。采樣后,瓶?jī)?nèi)應(yīng)留有空隙。如果與其他化驗(yàn)項(xiàng)目聯(lián)合取樣,細(xì)菌學(xué)分析水樣應(yīng)采在其他樣品之前。


(二)初發(fā)酵試驗(yàn)

1、水樣稀釋:制備水樣10-1、10-2的稀釋液,方法為用無菌移液管吸取水樣10mL放于盛有90mL無菌水和若干玻璃珠的錐形瓶中,充分振蕩使混合均勻,并使其中的細(xì)菌盡量呈單個(gè)存在,即為10-1稀釋液;再從10-1制備10-2稀釋液。以此類推,稀釋到所需倍數(shù)。

2、接種和培養(yǎng):以無菌操作于5支三倍濃縮培養(yǎng)基(接種前一定應(yīng)先檢查杜漢氏小管內(nèi)有無氣泡)中各加入水樣10mL,5支普通培養(yǎng)基試管中加入水樣1mL,5支普通培養(yǎng)基試管中加入10-1稀釋液1mL,小心混勻放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。此即5管法。

3、結(jié)果觀察:37℃中培養(yǎng)24h后取出觀察,觀察有無氣體(杜漢氏小管內(nèi)有無氣體)和酸產(chǎn)生(培養(yǎng)基有無變色)。在48h之間,培養(yǎng)管內(nèi)倒置的杜漢氏小管內(nèi)有任何量的氣體積累,或培養(yǎng)基顏色從紫色變?yōu)辄S色,便可初步斷定為陽性反應(yīng)。

若實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的15支管中均為陽性反應(yīng),說明濃水樣污染嚴(yán)重,可將樣品進(jìn)一步稀釋后,再按上述方法接種、培養(yǎng)和觀察。


(三)平板培養(yǎng)試驗(yàn)

將初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)酸產(chǎn)氣的后只產(chǎn)酸或只產(chǎn)氣的試管中的培養(yǎng)物用接種環(huán)取少許,劃線接種在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基或伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基平板上,為了確保獲得分離的單菌落,須注意以下事項(xiàng):

(1)劃線間距至少相隔0.5厘米;

(2)接種釘尖端要稍彎;

(3)先對(duì)試管輕擊并使之傾斜,以免接種針挑取到任何膜狀物或浮渣;

(4)劃線時(shí)要用針尖的彎曲部分接觸瓊脂培養(yǎng)基平面.以免刮傷或戳破培養(yǎng)基。劃線后培養(yǎng)皿倒置,于37℃培養(yǎng)18-24h。

24h后,觀察在平板上出現(xiàn)的單個(gè)菌落,其核心有深綠色金屬光澤者為較典型的大腸菌群菌落。盡可能挑取典型的或接近典型的大腸菌群菌落,在營養(yǎng)瓊脂斜面上劃線,置37℃培養(yǎng)24h。挑取斜面培養(yǎng)物制成涂片,進(jìn)行革蘭氏染色,凡屬革蘭氏陰性桿菌,即確認(rèn)了大腸菌群細(xì)菌的存在.


(四)復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)上述經(jīng)染色為革蘭氏陰性的典型菌落,用接種環(huán)刮取部分接種于盛有乳糖培養(yǎng)基的試管中,在37℃培養(yǎng)24h,陽性反應(yīng)者即確認(rèn)為大腸菌群細(xì)菌。


結(jié)果計(jì)算

在初發(fā)酵試驗(yàn)中,可能有極少數(shù)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的非大腸菌群細(xì)菌混在陽性可疑反應(yīng)管中,通過對(duì)初發(fā)酵中的陽性可疑管進(jìn)行平板和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn),并進(jìn)行革蘭氏染色和細(xì)菌形態(tài)的觀察,可將那些少量的非大腸菌群細(xì)菌(“假陽性管”)刪除去,故在記錄時(shí)只能把三步試驗(yàn)都呈陽性的試管計(jì)入陽性反應(yīng)管。

如果初發(fā)酵接種水樣量為10mL、1mL、0.1mL,可直接查表求出原水樣100mL中大腸菌群指數(shù)(MPN)。如果接種水樣量低于上述水樣量,則經(jīng)下面的換算式計(jì)算。


編輯:songjiajie2010

 
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