其實我們一般微生物實驗室自己還是可以做一些工作,特別是細(xì)菌的鑒定。再就是菌種鑒定時,不是直接拿來就鑒定,需要一些預(yù)先做一些處理或判斷,F(xiàn)將一些基礎(chǔ)知識進行總結(jié)如下:
一、相關(guān)定義
1、生理生化鑒定:根據(jù)微生物對各種生理條件(溫度、pH、氧氣、滲透壓)、生化指標(biāo)(唯1碳氮源、抗生素、酶、鹽堿性)代謝反應(yīng)進行分析,并將結(jié)果轉(zhuǎn)化成軟件可以識別的數(shù)據(jù),進行聚類分析,與已知的參比菌株數(shù)據(jù)庫進行比較,最終對未知菌進行鑒定的一種技術(shù)。
2、革蘭氏染色:系細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法,染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對比,可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征,而用以分類鑒定。
3、平板劃線法:系指把雜菌樣品通過在平板表面劃線稀釋而獲得單菌落的方法。
4、氧化酶試驗:氧化酶不直接與氧化酶試劑起反應(yīng),而是先使細(xì)胞-色素C氧化,然后此氧化型細(xì)胞-色素C再使對苯二胺氧化,產(chǎn)生顏色反應(yīng)而進行的試驗,用于區(qū)分不發(fā)酵的革蘭陰性桿菌(氧化酶陽性)和腸道菌(氧化酶陰性)。
5、觸酶試驗:大多需氧和兼性厭氧菌均產(chǎn)生過氧化氫酶,但鏈球菌屬陰性,故常用此試驗來鑒定,用于區(qū)分葡萄球菌(過氧化氫酶陽性)和鏈球菌(過氧化氫酶陰性)。
6、凝固酶試驗:用于區(qū)分凝固酶陰性葡萄球菌(可推測為非致病性)和凝固酶陽性葡萄球菌(很可能為致病性)。
二、工作程序
1、微生物鑒定程序
微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定,鑒定時一般先將待檢菌進行初步的分類。鑒定的方法有表型微生物鑒定和基因型微生物鑒定,根據(jù)所需要達(dá)到的鑒定水平選擇鑒定方法。目前實驗室室進行表型微生物鑒定后可以用API試劑條進行或其他等效的試劑條進行菌種鑒定,如API試劑條鑒定不能滿足要求時采取委外鑒定。
注:為了控制成本,可以自己進行鑒定,不具備能力時再委外。API鑒定用的試劑條的效期有限,需要注意效期或跟供應(yīng)商做好溝通備貨。
1.1 待檢菌的分離與純化
微生物鑒定的第一步是待檢培養(yǎng)物的分離純化,最chang用的分離純化方法是挑去待檢菌的純培養(yǎng)物(單個菌落),必要時可進一步進行純培養(yǎng),為表型鑒定和隨后的鑒定程序提供足夠量的菌體。從藥物原材料、制藥用水、生產(chǎn)環(huán)境、中間產(chǎn)品和最終產(chǎn)品的樣品中檢出的受損微生物,經(jīng)分離純化程序使其由不利生存易產(chǎn)生變化的狀態(tài)變?yōu)樵跔I養(yǎng)富集和最佳培養(yǎng)溫度條件下生存的穩(wěn)定狀態(tài),以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性,具體詳見表1。
表1待檢菌的分離與純化明細(xì)表
1.1.1 平板劃線法
平板劃線方法一般通過連續(xù)畫蛇形曲線或四區(qū)劃線方法進行。四區(qū)劃線具體步驟如下:先在平皿上做好標(biāo)識,然后在選擇所獲得的新鮮菌種進行劃線;左手持無菌平板,拇指和食指控制皿蓋,其余指控制皿底,打開皿蓋,用接種環(huán)在皿上進行劃線,一區(qū)要連續(xù)緊密的幾根平行線(如果菌量過多可以更換接種環(huán)),二區(qū)緊著著一區(qū)的最后一根線帶出來,劃幾根平行線,然后三區(qū)、四區(qū)同樣的操作,四區(qū)應(yīng)盡量避免接觸到菌落密集區(qū),影響單菌落的形成;最后再選擇適宜的溫度進行培養(yǎng)。
1.1 .2 稀釋倒平板法
首先把微生物懸液作一系列的稀釋(如1:10、1:100、1:1000、1:10000),然后分別取不同稀釋液少許,與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合,搖勻后,傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中,待瓊脂凝固后,制成可能含菌的瓊脂平板,保溫培養(yǎng)一定時間即可出現(xiàn)菌落。
如果稀釋得當(dāng),在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個菌落,這個菌落可能就是由一個細(xì)菌細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落,或重復(fù)以上操作數(shù)次,便可得到純培養(yǎng)。
1.1.3 涂布平板法
因為將微生物懸液先加到較燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡,且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長,因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。
其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿,制成無菌平板,冷卻凝固后,將一定量的微生物懸液滴加在平板表面,再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面,經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個菌落。
1.2 初篩實驗
常規(guī)的微生物鑒定,一般要先進行初篩試驗確定待檢菌的基本微生物特征,將待檢菌進行初步分類。常見的初篩試驗包括革蘭氏染色、芽孢染色、鏡檢觀察染色結(jié)果和細(xì)胞形態(tài)、重要的生化反應(yīng)等。
1.2.1 革蘭氏染色
原理:檢查細(xì)菌細(xì)胞壁的滲透性,染色前所有細(xì)胞是透明的,結(jié)晶紫著色后用碘增加染料與菌體結(jié)合,乙醇從G(-)菌體洗脫結(jié)晶紫,用番紅液復(fù)染,革蘭氏陰性菌呈粉紅色,革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色。
染色步驟:一般按照染色液說明書規(guī)定進行染色,如說明書無明確說明時按以下步驟進行染色。結(jié)晶紫初染,在載玻片上滴一小滴純化水,用灼燒過的接種針挑取少量細(xì)菌,置載玻片的水滴中與水混合并涂抹開,涂抹要均勻平坦,涂抹后直徑約為1 cm的薄層。
將載玻片在火焰上方快速來回通過一兩次,以載玻片的加熱面接觸手背皮膚,不覺過燙為佳,待冷卻后再在火焰上方來回通過一兩次,再冷卻,重復(fù)操作直到薄層干燥為止;在制好的片上滴一滴草酸銨結(jié)晶紫,染色1 min后用水洗;碘液媒染,加碘液一滴,作用1 min后用水沖洗,用過濾紙吸干;乙醇脫色,用95%乙醇脫色,脫色時間大概為30 s。水洗后用過濾紙吸干;番紅復(fù)染,滴加0.5%的番紅染色液一滴,染色10~30 s后,用自來水沖洗。
鏡檢:先低倍鏡,再高倍鏡,最后油鏡觀察,觀察菌落形態(tài)與菌落顏色,菌落呈紅色即革蘭氏陰性菌,呈藍(lán)紫色為革蘭氏陽性菌。
1.2.2 芽孢染色
一般按照染色液使用說明進行芽孢染色。如無明確說明時按以下步驟進行芽孢染色。涂片,先在載玻片上滴一滴純化水,用接種環(huán)灼燒過的接種針挑取少量細(xì)菌,置載玻片的水滴中與水混合并涂抹開,涂抹要均勻平坦,涂抹后直徑約為1 cm的薄層。
干燥固定,將載玻片在火焰上方快速來回通過一兩次,以載玻片的加熱面接觸手背皮膚,不覺過燙為佳,待冷卻后再在火焰上方來回通過一兩次,再冷卻,重復(fù)操作直到薄層干燥為止。孔雀綠覆蓋,用木夾夾住載玻片一端,加數(shù)滴5%孔雀綠染液覆蓋涂片,在微火上加熱至染料冒蒸汽并開始計時,維持5min。
沖洗,待玻片冷卻后,用緩流自來水沖洗載玻片背面,直至流出的水無色為止。復(fù)染,用0.5%番紅染液覆蓋玻片,保持3min。 水洗干燥,用緩流自來水沖洗載玻片背面,直至流出的水無色為止,使其自然干燥。鏡檢,觀察菌落是否含有芽孢。
1.2.3 氧化酶試驗(革蘭氏陰性桿菌)
革蘭氏陰性菌,做氧化酶試驗。取將待檢菌落于無菌的濾紙片上,滴加一滴氧化酶試劑,反應(yīng)3分鐘,出現(xiàn)紫色為陽性,反之為陰性。
1.2.4 非發(fā)酵菌鑒定
接種前把OF培養(yǎng)基在沸水浴溶解,在室溫冷卻后,每試驗分裝 2個安培的固體OF培養(yǎng)基,利用接種針挑單個菌落,穿刺到OF培養(yǎng)基(深度約1cm.),把其中一個已接種好的安培(OF.F),用石蠟油覆蓋1cm. 把兩個安培蓋上塑料帽,培養(yǎng)35-37°C , 24 – 48小時。
結(jié)果判定:兩瓶均為黃色,則為發(fā)酵菌,則為發(fā)酵菌,兩管培養(yǎng)基一瓶顯示綠色F-,一瓶顯示黃色O+。
1.2.5 觸酶試驗(革蘭氏陽性菌)
玻片法:挑取被撿菌落于玻片上,直接用試劑進行乳化,5s內(nèi)產(chǎn)生氣泡即為陽性結(jié)果,反之為陰性。
1.3 表型微生物鑒定
表型微生物鑒定依據(jù)表型特征的表達(dá)來區(qū)分不同微生物間的差異,是經(jīng)典的微生物分類鑒定法,以微生物細(xì)胞的形態(tài)和習(xí)性表型為主要指標(biāo),通過比較微生物的菌落形態(tài)、理化特征和特征化學(xué)成分與典型微生物的差異進行鑒別。微生物分類中使用的表型特征如表2。
表2 微生物分類中使用的表性特征表