概述
霉菌和酵母的檢測(cè)是我們食品微生物檢測(cè)的一個(gè)重要項(xiàng)目。霉菌是絲狀真菌的俗稱,絨毛狀、絮狀或蛛網(wǎng)狀的真菌菌落;沒有菌絲的稱之為酵母。這并非分類學(xué)名詞。
相對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō),霉菌和酵母生長(zhǎng)緩慢,競(jìng)爭(zhēng)能力較弱,故培養(yǎng)霉菌和酵母時(shí)要注意形成抑制細(xì)菌的環(huán)境。
下面是我們?cè)跈z測(cè)霉菌酵母時(shí)遇到的幾個(gè)問(wèn)題:
1、計(jì)數(shù)前的鑒定
計(jì)數(shù)霉菌酵母結(jié)果前是需要鑒定菌落是否是真菌的。
霉菌的形態(tài)相對(duì)比較明顯,不容易被混淆。但是對(duì)于酵母來(lái)說(shuō),培養(yǎng)基里抑制細(xì)菌的成分,例如氯霉素在此的劑量不足以抑制所有的細(xì)菌種類。部分細(xì)菌會(huì)在孟加拉紅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的也很好,如下圖:
被紅色圓圈圈起來(lái)的菌落是不是很像酵母?然而這只是一種革蘭氏陽(yáng)性的球菌而已,是細(xì)菌。
簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),真菌比細(xì)菌大得多。鏡檢如果使用低倍鏡(10-40倍)就可以清晰觀察到菌的輪廓,那么就是真菌。相反,如果需要油鏡等高倍鏡(1000倍以上),那就是細(xì)菌。
2、不同形態(tài)的菌落做鏡檢
“不同”形態(tài)的菌落,這個(gè)“不同”也是有區(qū)別的。如下圖所示:
圖2中紅色和藍(lán)色圓圈內(nèi)的這兩種“不同”形態(tài)的菌落,差別太大,確實(shí)是不相同的種類。
圖3中的四個(gè)“不同”的形態(tài)的菌落,其實(shí)是同一種酵母,這是釀酒酵母菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株在孟加拉紅培養(yǎng)基上因?yàn)樯L(zhǎng)位置不同而體現(xiàn)出的差異。生長(zhǎng)在瓊脂表面的菌落,白色透粉紅、圓形;生長(zhǎng)在瓊脂內(nèi)部的菌落,出現(xiàn)菱形或花瓣形;生長(zhǎng)在瓊脂底部和平皿接觸面上的菌落,呈現(xiàn)出較深粉紅色的圓形。
使用傾注法,同一種酵母可能會(huì)出現(xiàn)不同的形態(tài)。因此,挑取有代表性的菌落做鏡檢,我們要慎之又慎。不然會(huì)做重復(fù)工作或漏檢。
3、是否必須培養(yǎng)5天
在GB 4789.15-2016 中把“培養(yǎng) 5d,觀察并記錄”修改為“觀察并記錄培養(yǎng)至第 5d 的結(jié)果。”
部分霉菌適宜生長(zhǎng)的溫度稍高,如煙曲霉等,如果依然使用28℃培養(yǎng),酶的催化活性降低,代謝速度減慢,繁殖就會(huì)慢,就不能提前計(jì)數(shù)。還有幾類霉菌:毛霉、犁頭霉、木霉等生長(zhǎng)快、菌絲多,最好在48小時(shí)以內(nèi)計(jì)數(shù),否則菌絲就會(huì)覆蓋整個(gè)平皿,無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。
另外,有的菌株如果培養(yǎng)時(shí)間不足,形態(tài)特征會(huì)不明顯,不容易區(qū)分鑒別,因此需要延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。
4、標(biāo)準(zhǔn)方法與快檢方法相比
依據(jù)GB 4789.15-2016 ,食品實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)霉菌酵母的時(shí)間在很多情況下顯得過(guò)長(zhǎng),這也是近年來(lái)快速檢測(cè)方法需求大增的原因。很多實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行快檢產(chǎn)品驗(yàn)收時(shí),通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)使用黑曲霉菌和釀酒酵母菌,在孟加拉紅瓊脂上生長(zhǎng)速度也很快,大約2-3天就可以報(bào)告結(jié)果,和一些快檢方法相當(dāng)。
《GB 4789.28—2013 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄E中要求,實(shí)驗(yàn)室常備驗(yàn)收孟加拉紅瓊脂或馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基所使用的霉菌酵母的標(biāo)準(zhǔn)菌株為黑曲霉菌和釀酒酵母菌,因此大部分實(shí)驗(yàn)室如果做國(guó)標(biāo)法和快檢方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn),往往使用的也是這兩種菌株。
但是我們要知道,GB 4789.28—2013 中附錄E,半定量質(zhì)控評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)G值所采用的質(zhì)控菌株(目標(biāo)菌),生長(zhǎng)繁殖速度相對(duì)較快,特征明顯。以釀酒酵母菌為例,如果對(duì)純菌液樣液(無(wú)抑制成分、無(wú)干擾菌)傾注孟加拉紅瓊脂,28℃下培養(yǎng)48-72h就足以計(jì)數(shù),繼續(xù)培養(yǎng)也不過(guò)是使菌落變的更大。如果培養(yǎng)溫度升高1-2℃,這一速度還將更快。同理,黑曲霉菌3天也已經(jīng)足夠。
現(xiàn)有的類似培養(yǎng)基培養(yǎng)的快檢方法,如3M霉菌酵母快速檢測(cè)紙片,或者Biokar霉酵快速顯色培養(yǎng)基等檢測(cè)霉酵的時(shí)間大都為2-3天,這樣一來(lái),對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往在培養(yǎng)2-3天后就可以全部觀察到,會(huì)給人造成一種錯(cuò)覺:經(jīng)過(guò)國(guó)際權(quán)威組織認(rèn)證的快速檢測(cè)方法,檢測(cè)時(shí)間和孟加拉紅瓊脂差不多,那么日常檢測(cè)中,培養(yǎng)了3天左右的孟加拉紅瓊脂上未長(zhǎng)菌,是不是就可以下結(jié)論了呢?
實(shí)際上,培養(yǎng)了3天左右的孟加拉紅瓊脂上未長(zhǎng)菌,在第四天或第五天開始出現(xiàn)霉菌酵母的情況是存在的。
以《SN/T 3266食品微生物檢驗(yàn)方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》為例,對(duì)非標(biāo)方法(定量)選擇性的要求就包括:包容性≥98% (30個(gè)目標(biāo)菌株),并不能以某種菌株的結(jié)果代表所有情況。
在本文前面已經(jīng)提到,霉菌酵母的種類非常之多,GB 4789.15中將培養(yǎng)時(shí)間定在5天,也是考慮到在此培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)繁殖比較緩慢的情況。除少情形(培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致蔓延等)外,培養(yǎng)時(shí)間一定要足夠。
Symphony 瓊脂可對(duì)所有人類和動(dòng)物食品中的酵母菌和霉菌進(jìn)行計(jì)數(shù),與其水活性無(wú)關(guān)。也可用于生產(chǎn)區(qū)域環(huán)境樣品的控制。該方法允許在54小時(shí)后進(jìn)行計(jì)數(shù),而不是使用標(biāo)準(zhǔn)方法的5天。
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