濾光系統(tǒng)
酶標(biāo)儀最簡(jiǎn)單的是用濾光方式來(lái)劃分。一般來(lái)說(shuō),可以分為濾光片型和光柵型兩大類。也有一些酶標(biāo)儀里面同時(shí)裝上了濾光片和光柵。但是濾片和光柵并不能同時(shí)完成同一個(gè)檢測(cè),本質(zhì)上還只是把濾片和光柵放在了一起,并沒(méi)有使兩者糅合而產(chǎn)生新的技術(shù)突破。
光柵型濾光系統(tǒng)具有使用方便,可以進(jìn)行光譜掃描,靈活性等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)然,濾光片系統(tǒng)也有其顯著的優(yōu)勢(shì),例如價(jià)格較為便宜,檢測(cè)靈敏度高,帶寬的可選擇性,可以進(jìn)行快速的濾光片切換,可配備有自動(dòng)加樣系統(tǒng),在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)中光線的透過(guò)率高。
目前,濾光片系統(tǒng)應(yīng)用更廣,因?yàn)樗梢宰寣?shí)驗(yàn)者完成更多的試驗(yàn)。
測(cè)定波長(zhǎng)
一般酶標(biāo)儀的測(cè)定波長(zhǎng)在400~750nm或800nm之間,完全可以滿足ELISA的顯色測(cè)定。目前國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過(guò)氧化物酶(HRP),底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD),其在過(guò)氧化氫溶液的存在下,經(jīng)HRP作用,分別氧化為2,2,—二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。當(dāng)pH值為5.0左右時(shí),DAB在450nm波長(zhǎng)處有最大吸收,當(dāng)pH值降為L(zhǎng) 0時(shí),最大吸收波長(zhǎng)移至492 nm,同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大,顯色加深,因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長(zhǎng)450nm處有最大消光系數(shù),如果HRP量少,H:O:和TMB過(guò)量時(shí),則形成藍(lán)色的陽(yáng)離子根。降低pH,即可使藍(lán)色的陽(yáng)離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌,使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min。因此,450nm和492 nm兩個(gè)波長(zhǎng)是目前ELISA測(cè)定最常用的。各種酶標(biāo)儀都配有放置濾光片的可自動(dòng)轉(zhuǎn)換的部件,可以同時(shí)安裝6~8片濾光片,所配備的濾光片均應(yīng)包括上述兩個(gè)波長(zhǎng),有的酶標(biāo)儀以490nm濾光片替代492nm濾光片,影響不大。除了這兩個(gè)基本濾光片外,考慮到雙波長(zhǎng)比色的需要,還應(yīng)有620nm或630nm或650nm和405nm波長(zhǎng)的濾光片,其他濾光片可根據(jù)自己的需要選擇。有時(shí),有的實(shí)驗(yàn)室希望用酶標(biāo)儀作微量生化測(cè)定,故酶標(biāo)儀生產(chǎn)廠家對(duì)其生產(chǎn)的酶標(biāo)儀擴(kuò)展了紫外檢測(cè)功能,此時(shí)需要一個(gè)340 nm波長(zhǎng)濾光片。此時(shí),酶標(biāo)儀的測(cè)定波長(zhǎng)范圍就成為340—750nm或800nm。
酶標(biāo)儀有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)檢測(cè)功能。有時(shí)使用者不知在什么情況下使用單或雙波長(zhǎng)檢測(cè)。所謂的“單波長(zhǎng)”就是使用一種對(duì)顯色具最大吸收的波長(zhǎng)即450 nm或492 nm進(jìn)行比色測(cè)定;而“雙波長(zhǎng)”則除了用對(duì)顯色具最大吸收的波長(zhǎng)即450 nm或492 nm進(jìn)行比色測(cè)定外,同時(shí)用對(duì)特異顯色不敏感的波長(zhǎng)如630 nm進(jìn)行測(cè)定,酶標(biāo)儀最后打印出來(lái)的吸光度則為二者之差。630 nm波長(zhǎng)下得到的吸光度是非特異的,來(lái)自于板孔上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此,在ELISA比色測(cè)定中,最好使用雙波長(zhǎng),且不必設(shè)空白孔。
測(cè)定的吸光度范圍
測(cè)定的吸光度范圍
通常,酶標(biāo)儀的吸光度測(cè)定范圍在0~2.5之間即可以滿足ELISA的測(cè)定要求。早期的酶標(biāo)儀可測(cè)定的吸光度一般在0~2.5之間,但現(xiàn)在基本上都做了拓寬,可達(dá)到3.5以上,并且能保持很好的精密度與線性。因此,對(duì)于酶標(biāo)儀的吸光度范圍不必去刻意追求大的吸光度范圍,主要要看在一定的吸光度范圍內(nèi)的線性和精密度如何。
光學(xué)系統(tǒng)
酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)采用的是垂直光路多通道(通常為8或12通道,亦有單通道)檢測(cè),一般為硅光管或光導(dǎo)纖維,除測(cè)定通道外,有的酶標(biāo)儀還有一個(gè)參比通道,每次測(cè)定可進(jìn)行自我校準(zhǔn)。酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)功能如何,均可通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定的吸光度范圍、線性度、精密度和準(zhǔn)確度等體現(xiàn)出來(lái)。光學(xué)系統(tǒng)好的話,則上述指標(biāo)也應(yīng)較佳。測(cè)定的精密度與測(cè)定通道之間的均一性有直接關(guān)系。單通道可避免因通道不同所致的差異。
檢測(cè)速度
酶標(biāo)儀的檢測(cè)速度是指其完成比色測(cè)定所需要的時(shí)間。檢測(cè)速度快,有利于提高檢測(cè)的精密度,即避免由于測(cè)定過(guò)程中,因測(cè)定時(shí)間不同所致的各微孔間吸光度間的差異。目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的酶標(biāo)儀檢測(cè)速度都非?,通常在數(shù)秒鐘內(nèi)。
震板功能
酶標(biāo)儀的震板功能是指酶標(biāo)儀在對(duì)ELISA板孔進(jìn)行比色測(cè)定前對(duì)其進(jìn)行振蕩混勻,使板孔內(nèi)顏色均一。目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的酶標(biāo)儀均有震板功能,所不同的是震板方式,有的可按上下、左右或旋轉(zhuǎn)等方式及振蕩幅度等任意調(diào)節(jié);有的則較為固定。使用有震板功能的酶標(biāo)儀,在進(jìn)行ELISA測(cè)定顯色反應(yīng)完成加入終止劑后,可不必振蕩混勻,直接放人酶標(biāo)儀上測(cè)定即可。
溫育功能
溫育功能是指酶標(biāo)儀本身能按要求自動(dòng)精確地控制儀器內(nèi)部的溫度,使得ELISA測(cè)定中微孔板條的溫育過(guò)程可在儀器內(nèi)部完成,而無(wú)需再外配溫箱。目前,只有少部分酶標(biāo)儀具有此種功能,溫育功能只是酶標(biāo)儀的一個(gè)附加功能,是否具有并不能說(shuō)明酶標(biāo)儀檔次的高低及儀器的優(yōu)劣。作為實(shí)驗(yàn)室是否選擇,則可根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的條件及需要來(lái)決定。
軟件功能
軟件功能是指酶標(biāo)儀所具有的對(duì)ELISA定性和定量測(cè)定及其他測(cè)定方式如酶標(biāo)動(dòng)力學(xué)、紫外和凝集等數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析并報(bào)告結(jié)果的功能。軟件功能是中高檔酶標(biāo)儀的一個(gè)非常重要的功能。如果硬件方面區(qū)別不大,則軟件就成為判定酶標(biāo)儀優(yōu)劣的惟一指標(biāo)。對(duì)于用戶來(lái)說(shuō),好的軟件功能,對(duì)實(shí)際工作會(huì)有較大的幫助。ELISA定性測(cè)定,酶標(biāo)儀如具有陽(yáng)性判斷值(cut-off)及其測(cè)定“灰區(qū)”(即指測(cè)定吸光度處于cut—off周圍的一定區(qū)域,此區(qū)域內(nèi)結(jié)果應(yīng)為“可疑”)的統(tǒng)計(jì)計(jì)算功能,不但方便了實(shí)驗(yàn)室工作人員,而且在某些特定的情況下,有很高的實(shí)用價(jià)值。因此,如目的是定量測(cè)定,則在酶標(biāo)儀的軟件功能中,最好要有這種曲線回歸方程計(jì)算分析功能。其他諸如連點(diǎn)、直線等回歸計(jì)算,則可根據(jù)酶標(biāo)儀的應(yīng)用目的而定,如兼用于微量生化測(cè)定,則此類回歸計(jì)算就很有必要。
此外,酶標(biāo)儀兼做酶標(biāo)動(dòng)力學(xué)、凝集反應(yīng)測(cè)定所需的軟件是否應(yīng)具備,當(dāng)然也應(yīng)根據(jù)使用目的而定。由于此類軟件一般都較為昂貴,酶標(biāo)儀常另外單獨(dú)按需配備,如果不是實(shí)驗(yàn)室特殊需要,就不必強(qiáng)求這種軟件功能。
語(yǔ)言界面
通常進(jìn)口的中高檔酶標(biāo)儀人機(jī)對(duì)話多采用英文。這對(duì)于某些基層實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)存在語(yǔ)言方面的困難,從而難以最大限度地發(fā)揮酶標(biāo)儀的作用。為解決這方面的問(wèn)題,已有一些酶標(biāo)儀采用了中文界面。這樣就大大方便了廣大基層實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的使用。
綜上所述,盡管酶標(biāo)儀的發(fā)展極為快速,種類繁多,功能也不斷加強(qiáng),但其最根本的功用是不變的,即比色測(cè)定。大凡比色測(cè)定,其基本要求就是在一定吸光度范圍內(nèi)要有好的測(cè)定準(zhǔn)確性、線性和精密性。同樣的吸光度范圍,測(cè)定的準(zhǔn)確性、線性和精密性越好則酶標(biāo)儀亦越佳。
而且,由于用于酶標(biāo)儀比色測(cè)定的為多孔(通常為96孔)微孔板條,為保證測(cè)定的孔間重復(fù)性,則測(cè)定速度也是一個(gè)較重要的性能指標(biāo)。至于其他如震板、溫育及有關(guān)的軟件功能,則是選配功能,不影響酶標(biāo)儀其他的使用性能。