食品伙伴網(wǎng)服務號
當前位置: 首頁 » 檢驗技術 » 培訓資料及講義 » 正文

蛋白質(zhì)雙向電泳過程與體會

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-06-19  來源:生物無憂
核心提示: 雙向電泳IEF (sigma)IEF(not IPG)/SDS-PAGE最簡單的裝備推薦如下,適合于沒多少money做IPG又想做熱的所謂蛋白質(zhì)組的. IEF用
    雙向電泳IEF (sigma)IEF(not IPG)/SDS-PAGE最簡單的裝備推薦如下,適合于沒多少money做IPG又想做“熱”的所謂蛋白質(zhì)組的.
    IEF用Biorad的圓盤電泳槽(不行用國產(chǎn)的吧,不推薦),SDS-PAGE用六一廠的就可以了(ft,六一廠應該給我money吧,給你做廣告了)(money不是很多的強烈推薦六一的,買進口電泳槽的錢留出來測搞出的差異蛋白質(zhì)的序列吧,呵呵)
    BIO-RAD 的圓盤電泳槽,國產(chǎn)的不推薦,因為 上槽 Biorad 的鉑金絲凹進去了一點,不是很進去,而國產(chǎn)的凹得太進去了以至于電聚焦時產(chǎn)生的氣泡繞在鉑金絲一圈,影響電聚焦.
雙向電泳
1.蛋白質(zhì)樣品制備
    秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal 等(1986)的方法進行.100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸(丙酮配制,含10mM 即0.07%β- 巰基乙醇),混勻,-20℃沉淀1 小時,4℃,15000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀復溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇),再于-20℃沉淀1小時,同上離心棄上清,(有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干.
    按每mg干粉加入20μl(可調(diào))UKS液[9.5 M尿素,5mM 碳酸鉀,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫蘇糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃育30min,期間攪動幾次,28度 (溫度低,高濃度的尿素會讓溶液結冰)16000 r/min離心15 min,離心力越大時間長一點越好!上清即可上樣電泳.或者-70度保存
2 蛋白質(zhì)濃度測定
    按Garrels(1983)的程序,稍加改動.10μl上述用UKS液制得的蛋白質(zhì)樣品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸,冰浴30min后,4℃,4000 r/min離心15min,棄上清,再加入100μl冷丙酮,同上離心5min,棄上清,凍干沉淀,用100μl PBS溶液復溶,并按Bradford(1976)的程序測定蛋白質(zhì)濃度.說實話,好象Bradford法不太好做
2.3.1 電聚焦(IEF)
2.3.1.1 玻管準備
    干凈玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部,在16cm處作好標記,垂直放在泡沫板上.電聚焦的管子,買原裝的也可以,實在不行自己也可以做的,1ml 的移液管,內(nèi)徑1.5mm左右的,長度取18cm,用玻璃刀做,呵呵,很容易的;玻璃管的處理,先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr,用自來水沖后;用雙蒸水沖,用雙蒸水泡至少1hr,中間至少換2,3 次水;后用2M的HCL 泡至少1 個小時,用雙蒸水沖,(不能用自來水沖),然后雙蒸水泡至少1 個小時,中間換3,4 次水,可多泡一會.最后泡在無水乙醇里面1hr,轟干就可以用了.
2.3.1.2 凝膠制備與電聚焦
    灌IEF的配方為
    3.09克尿素
    1.125 ml 10%NP-40
    1.125ml 水
    0.735ml 30%屏息現(xiàn)案 (ACR 28.38 BIS 1.62)
    0.15 ml Am 3.5-10
    0.375ml Am 5-7
    8微升 10%AP
    1.8微升TEMED
    用注射器吸好膠液,裝上7號針頭,將7號針頭插入玻管底部,邊推注射器邊提針頭,直到標記處,用微量進樣器小心加入少量水,可見明顯的界面出現(xiàn),讓其聚合1小時以上,適當長一點的時間好一些,我一般是頭天下午灌膠,第2 天下午才開始跑電泳.待膠聚合好后,除去Parafilm并吸去頂部的覆蓋液,加樣80μg,上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口,不要破壞樣品與NaOH 的界面.即可進行電泳.電極液為:上槽(負極)為50m mol/L NaOH 液,下槽(正極)為25m mol/L H3PO4.按 200V×15min,300V×30min,400V×18h,1000V×1h的程序進行電聚焦.或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37 度左右,特別是冬天,我的方法是 溫控儀控制 暖風機 在37 度暖風機和電泳槽在一個大的紙箱(密封)里.呵呵,應該可以想象得到吧,第一向溫度特別重要,不然,電聚焦肯定做不好.
2.3.1.3 電泳后的凝條處理
    電聚焦完畢后,用注射器吸滿水,套上一個200μl的槍頭,當然槍頭與注射器間用parafilm封住防漏氣.從頂部向下注水使膠條向下滑出.當然,剛開始做的時候肯定不熟,很不爽,有時候你會唱 想哭卻又哭不出來,呵呵,熟悉了就快了,注射器 槍頭玻璃管必須為一直線,消息不要把注射器的頭搞斷了.取一膠條,用雙蒸水洗凈兩端,按酸端到堿端的順序切成0.5cm 的小段,各自浸入含1.3ml 抽氣后雙蒸水的Eppendorf管中過夜,次日用酸度計分別測定各段的pH值,以凝膠長度為橫坐標,pH值為縱坐標作圖,即為等電點標準曲線.漫漫擠,管子,200 衛(wèi)生槍頭,注射器,要成一直線,,要用一手扶著管子,一手拿住200 衛(wèi)生槍頭,保證水不從槍頭和管子處流出來,注射器頂在胸前把膠條擠出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久,想什么時候跑SDS-PAGE就什么時候跑.絕招哦,不要隨便亂傳,嘿嘿!還可以馬上看一下,膠條上有蛋白質(zhì)沒有,有的話一下就可以看見了.那些說什么放在平衡液里,-20 度的,肯定不行,呵呵!就跟你用考染IEF 膠條一樣的,帶,可能先在12%的TCA 里面看不見,不過你再把它放在水里面,泡一會帶就出來了.不過在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要換至少5 次水,每次用不同的小平皿.
    注意到下級液 磷酸 部分的膠條沒,是不是有一節(jié)約2cm左右,比較突出,沒有膨大的部分呀!只是在tca泡的時候磷酸段有一小截變白的速度比較慢,大約3cm左右,呵呵!
    對要進行第二向SDS-PAGE 的膠條則必須用平衡液[2.3%SDS,62.5m mol/L Tris-HCL(pH6.8),10%甘油,5%β-巰基乙醇,0.1%溴酚藍]進行二次平衡,第一次20min,第二次25min.第2 次的溶液為新的.一般我是把第2次用過的當成第一次的用 .平衡過程中每隔幾min輕輕的晃一下小平皿.
2.3.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
    選用DYY-Ⅲ型(北京六一儀器廠生產(chǎn))電泳槽(規(guī)格為200×200×1mm),分離膠濃度為12%,無濃縮膠.待膠聚合后,將電聚焦后已經(jīng)平衡的膠條平放于濃縮膠頂端(避免膠條拉直),并用1%瓊脂糖(電極緩沖液配制)封膠,特別應注意避免膠條與分離膠上沿產(chǎn)生氣炮.61 廠板子之灌膠:堅決不用凡士林,用透明膠將兩端(板子的2 邊)封住,再用2%瓊脂之SDS-PAGE 電極液封底,待瓊脂凝固后再灌膠,最后用水封膠.over!
    做之前,一定要保證,1,灌膠不會有任何問題,不能漏,2,不用濃縮膠,只用分離膠.3,分離膠用水封,要保證凝聚好的PAGE 膠,為一平的線,凹來凸去的就不要用了.玻璃版能用硅化劑最好不過了.防止從邊上漏,我用透明膠(約4cm寬),封住兩邊,下面還是用2%的瓊脂封.灌好電極緩沖液[25m mol/LTris,192m mol/L 甘氨酸及0.1%SDS],按25mA/板膠恒流進行電泳,待溴酚蘭離底部1cm時即可停止電泳,一般電泳耗時約4-5h.銀染:凝膠于40%甲醇,10%醋酸中固定1h以上或者過夜;用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min;水洗6×5min; 0.02%硫代硫酸鈉1min;水洗3×20s;0.2%硝酸銀,0.02%甲醛快速的潤洗一次,就是過一下的意思,到這個溶液進去,馬上又倒掉;0.2%硝酸銀,0.02%甲醛20min;水洗3×20s;顯色液(3%碳酸鈉,0.05%甲醛,0.0005%硫代硫酸鈉)快速的潤洗一次,就是過一下的意思,到這個溶液進去,馬上又倒掉;顯色液(3%碳酸鈉,0.05%甲醛,0.0005%硫代硫酸鈉)顯色到你所希望的程度,自己看,背景好,點又多的話就可以了;水洗20秒;0.05%甘氨酸停顯.染色理想溫度:我去年4,5月時,通常染色都定在中午,12點多;溫度最好是20 度左右,(這個溫度我也沒控制的)100%TCA領一瓶TCA 500g的那種 按分子克隆上的好象是直接加200多ml 水就成100%TCA了10%TCA,0.07%2-ME 丙酮 (100ml):
    100%TCA 10ml
    2-ME 0.07ml
    丙酮 90ml
    0.07%2-ME 丙酮 (100ml):
    2-ME 0.07ml
    丙酮 100ml
    0 Farrel 液(9.5M Urea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5% 2-ME)50ml
    Urea 28.5g
    NP-40 1ml
    Ampholine 5~7 2.0ml
    3.5~10 0.5ml
    2-ME 2.5ml
    注意定容!配好后用1.5ml 管分裝!-70度保存
    注意 這兩個溶液 配的時候 比如配 50ml 用100ml的燒杯 用量筒量50ml 水 倒如燒杯里面,用記號筆標上刻度,然后把水倒掉,再稱 尿素 小量加水,因為尿素加水后體積會變大,再37 度水域鍋里溶,然后加其它成分,最后再定到50ml
    UKS液 (含9.5M Urea,5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.5~10),6%Triton X-100)
     25ml 50ml
Urea 14.25g 28.5g
K2CO3 17.25mg 34.5mg
SDS 0.3125g 0.625g
DTT 0.125g 0.25g
    2-ME
    Ampholine(3.5~10)1.25ml 2.5ml
    Triton X-100 1.5ml 3ml(0.86ml 2 槍,4槍)
    2-ME 可適當加一些!注意定容!配好后用1.5ml管分裝!-70度保存!
雙向電泳IPG(summer)
一、樣品提。喝却姿—丙酮沉淀法
(1)在液氮中研磨葉片
(2)加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜,然后離心(4℃8000rpm以上1 小時)棄上清.
(3)加入等體積的冰浴丙酮(含0.07%的β-巰基乙醇),搖勻后離心(4℃8000rpm以上1小時),然后真空干燥沉淀,備用.
(4)上樣前加入裂解液,室溫放置30 分鐘,使蛋白充分溶于裂解液中,然后離心(15℃8000rpm以上1小時或更長時間以沒有沉淀為標準),可臨時保存在4℃待用.
(5)用Brandford法定量蛋白,然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆?
二、一向電泳(13cm的holder)
(1)取大約70-100ng的蛋白與溶脹液混合總體積達到250vl
(2)將上述溶液加到holder 的兩個電極之間.
(3)去掉膠條的保護膜,膠面朝下,先將膠條尖端朝膠條槽的尖端方向放入膠條槽中,慢慢下壓膠條,并前后移動,避免生成氣泡,最后放下膠條平端,使溶液浸濕整個膠條.
(4)在膠條上覆蓋適量的覆蓋油,蓋上蓋子.
(5)將膠條槽平放于一向儀器上,與水平方向垂直.
(6)設置儀器的運行參數(shù):
三、膠條的平衡(由一向到二向)
(1)將膠條放入10ml 平衡緩沖液中(加入10mgDTT)封口,在振蕩儀上振蕩15 分鐘.
(2)將膠條取出放入10ml 新的平衡緩沖液中(加入250mg 的碘乙酰胺)封口,在振蕩儀上振蕩15 分鐘.
(3)用去離子水潤洗膠條一秒鐘,將膠條的邊緣置于濾紙上幾分鐘,以去除多余的平衡緩沖液.
四、二向電泳
(1)將平衡好的膠條直接轉(zhuǎn)移到第二向制好的SDS膠上,然后用瓊脂糖封頂,準備第二向電泳.
(2)設置儀器的運行參數(shù):
 
五、平板膠的染色
    硝酸銀染色:(整個操作在搖床上進行)
(1)固定:25ml的冰醋酸,100ml甲醇,125ml 去離子水,60 分鐘.
(2)敏化:75ml甲醇,0.5g硫代硫酸鈉(使用之前加入),17g醋酸鈉,165ml去離子水,30分鐘.
(3)清洗:用250ml 的去離子水清洗3 次每次5 分鐘.
(4)銀染:0.625g硝酸銀,250去離子水,(使用之前配制)20 分鐘.
(5)顯色:6.25g碳酸鈉,100vl 的甲醛(使用之前加入),250ml 去離子水.
(6)終止:5%的醋酸.
(7)照相分析.
(8)保存制作干膠.
藥品:
提取液:含10%TCA 和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮裂解液:2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 滅菌的去離子水中(終體積為5ml),使用前再加入1M 的DTT65μl/ml.
平衡緩沖液:1.5MTris-Cl ph8.8 6.7ml,尿素72.07g ,87%的甘油69ml,SDS 4g,溴酚藍少許.溶漲液:尿素12g,CHAPS0.5g,溴酚藍少許溶于無菌水中,總體積為25ml.使用之前再加入IPG緩沖液 0.5vl/100vl,DTT1.5vl/100vl.
制作平板膠:
分離膠的配制方法:
    藥品/濃度 5% 7.5% 10% 12.5% 15%
    丙烯酰胺 6.7ml 10ml 13.3ml 16.7ml 20ml
    分離膠緩沖液 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml
    10×SDS 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml
    無菌水 22.7ml 19.4ml 16.1ml 12.8ml 9.5ml
    10%過硫酸胺* 200vl 200vl 200vl 200vl 200vl
    TEMED* 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl
    *在灌膠之前加入 
藥品配制:
    丙烯酰胺單體儲液:丙烯酰胺60g甲叉雙丙烯酰胺1.6g溶于無菌水中總體積200ml分離膠緩沖液:Trisbase181.5g 溶于750ml 無菌水中調(diào)pH8.8總體積1000ml10%SDS:SDS5g溶于無菌水中總體積50ml10%的過硫酸胺:0.1g溶于無菌水中總體積1mlSDS 電泳緩沖液:Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于無菌水中總體積5000ml
    封膠溶液:SDS電泳緩沖液100ml 瓊脂糖0.5g溴酚藍少許附:蛋白質(zhì)含量測定的方法(Bradford 方法)
原理:這一方法基于2 考馬斯亮藍G-250 有紅藍兩種不同的形式.在一定濃度的乙醇及酸性條件下,可配成淡紅色的溶液,當與蛋白質(zhì)結合后,產(chǎn)生藍色化合物,反應迅速而穩(wěn)定.反應化合物在 465-595nm處有最大的光吸收值,化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關系,因此可檢測595nm的光吸收值的大小計算蛋白的含量.
   溶液:
1)Bradford儲存液
    100ml95%乙醇
    200ml88%磷酸
    350mgServaG藍
    室溫下長期保持穩(wěn)定.
2)Bradford工作液
    425ml雙蒸水
    15ml95%乙醇
    30ml88%磷酸
    30ml Bradford儲存液
    用濾紙過濾,保存于室溫棕色瓶中,可保存數(shù)周,但在使用前需要過濾.
3)配制1mg/ml牛血清蛋白(BSA)
    做標準曲線:取樣品即可測量.
    注意事項:
1、樣品的問題:
    樣品制備是做好2-d 的關鍵,這句話好象有點多余,如果樣品中離子濃度過大,根本做不了2d,我開始的時候由于提取方法有問題,結果浪費了很多時間和IPG膠條,真的很心痛呀!另外再說明一點,最好用新鮮的樣品提取蛋白質(zhì),蛋白點的差異很大,新鮮的樣品點多,而我用存放在-80 的樣品跑出來效果差了很多呀!如果你不確定你的蛋白提的如何,建議你先跑sds-page.檢驗一下.關于蛋白的提取方法,我還想聽聽各位的建議.
2、上樣量的問題,我覺得我跑的這張2D 圖,上樣量還需要調(diào)整,可以適當降低,我的ipg 膠條是13 厘米的上樣量在50ng-80ng之間,上樣量不合適,豐度低的將會被豐度高的所遮蓋,這是最討厭的問題.
3、跑一向的時候大家都差不多,根據(jù)公司的說明就可以做了.跑二向的時候我現(xiàn)在一般做恒壓,以前做過恒流,沒感覺有什么差異,還想請教各位!橫流和恒壓到底哪個更好一些!
4、ipg 膠條ph 的選擇,我做的是植物的花藥,一般情況下酸性端點多一點,堿性端較少,我現(xiàn)在選用的是ph3-10 的,我覺得很不合適,(不過這個膠條是免費的)因此好多點沒能很好的分開,如果膠條的ph小一點,膠條(我希望能達到18cm)可是我們這里做不了,效果應該比這個好很多的!
5、從這塊膠上,我覺得致命點就是背景深,將影響我下一步的分析.所以銀染還需要改進!
6、針對不同的蛋白質(zhì),分離膠的濃度也是可以調(diào)節(jié)的,我比較懶,就作過10%,12.5%的,不過覺得都不適合.
 
編輯:songjiajie2010

 
分享:
[ 網(wǎng)刊訂閱 ]  [ 檢驗技術搜索 ]  [ ]  [ 告訴好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 關閉窗口 ] [ 返回頂部 ]
 

 
 
推薦圖文
推薦檢驗技術
點擊排行
檢驗技術
 
 
Processed in 0.150 second(s), 14 queries, Memory 0.92 M