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蛋白質(zhì)被認(rèn)為是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分。食物中的蛋白質(zhì)是人體中氮的唯一來(lái)源，具有糖類(lèi)和脂肪不可替代的作用。含氮量是蛋白質(zhì)區(qū)別于其他有機(jī)化合物的重要標(biāo)志。
牛乳中的蛋白質(zhì)含量為3%～3.7%，是主要的含氮物質(zhì)，其中主要為酪蛋白和乳清蛋白，還有少量的脂肪球膜蛋白。乳蛋白就整體而言，富含必需氨基酸且配比適宜，比自然界中任何其他天然食物都多，但酪蛋白中蛋氨酸的含量卻較少。
在檢驗(yàn)食品中蛋白質(zhì)時(shí)，通常是先檢定出食品中的總氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，以此得到蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過(guò)程。
一凱氏定氮法的原理及步驟
蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨，與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)（乳及乳制品換算系數(shù)為6.38），即為蛋白質(zhì)的含量。
（1）消化
濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮。濃硫酸又具有氧化性，可將有機(jī)物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原為二氧化硫。二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。
蛋白質(zhì)+13H2SO4→(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
消化時(shí)加入的硫酸銅是作催化劑，以加速分解反應(yīng)，還可以加入氧化汞、氧化銅等作催化劑，為防止汞的污染，通常用硫酸銅較多。如果以汞或汞化合物作催化劑，則消化和加堿后，形成汞氨化合物。此化合物在蒸餾時(shí)不能完全分解，在這種情況下，必須加入鋅粉或硫代硫酸鈉或硫化鈉，使汞氨化合物分解。
C+2CuSO4→Cu2SO4+SO2↑+CO2↑
Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+SO2
有機(jī)物消化完后，溶液具有清澈的硫酸銅的藍(lán)綠色，同時(shí)硫酸銅在下一步蒸餾時(shí)可作堿性反應(yīng)的指示劑。
在消化過(guò)程中添加硫酸鉀，與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀，是為了提高溶液沸點(diǎn)，從而提高反應(yīng)溫度，加速反應(yīng)過(guò)程。此外，也可以加硫酸鈉、氯化鉀等鹽類(lèi)來(lái)提高沸點(diǎn)。
在消化過(guò)程中，隨著硫酸的不斷分解、水分的不斷蒸發(fā)，硫酸鉀的濃度逐漸增大，沸點(diǎn)升高，加速了對(duì)有機(jī)物的分解作用。
加入過(guò)氧化氫，是利用其氧化性，以加快反應(yīng)速度：
2H2O2→O2+2H2O
（2）蒸餾
在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，通過(guò)加熱蒸餾，氨隨水蒸氣蒸出：
(NH4)2SO4+2NaOH →2NH3+Na2SO4+2H2O
（3）吸收
加熱蒸餾時(shí)放出的氨可用硼酸溶液進(jìn)行吸收。溫度過(guò)高會(huì)使硼酸吸收液對(duì)氨的吸收作用減弱，從而造成損失，故一般不超過(guò)40 ℃。
2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O
（4）滴定 待吸收完全后，用硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定生成的硼酸銨，屬于鹽類(lèi)的滴定。硼酸為極弱的酸，在滴定中并不影響所用指示劑的變色反應(yīng)。
(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O→(NH4)2SO4+4H3BO3
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3
（5）計(jì)算 根據(jù)硫酸或鹽酸溶液消耗的體積，計(jì)算總氮含量，再乘以蛋白質(zhì)系數(shù)（乳及乳制品換算系數(shù)為6.38），即為粗蛋白的含量。
二注意事項(xiàng)
（1）加入樣品及試劑時(shí)，避免黏附在瓶頸上。
（2）加入硫酸鉀的作用：提高硫酸的沸點(diǎn)（338℃），增進(jìn)反應(yīng)速度。但過(guò)多的硫酸鉀會(huì)造成沸點(diǎn)太高。生成的硫酸銨在513℃會(huì)分解，故此加入硫酸鉀的量一定要準(zhǔn)確。
（3）加入硫酸銅的作用：催化劑，使氧化作用加速。
（4）消化時(shí)，采用長(zhǎng)頸圓底凱氏燒瓶斜支于電爐上，其操作必須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，并使全部樣品浸泡在消化液中，防止樣品黏附在瓶頸上部，以致消化不完全；在消化過(guò)程中，樣品炭化變黑，產(chǎn)生泡沫，這時(shí)要減小火力。勿使黑色物質(zhì)上升到凱氏燒瓶頸部，待消化液均勻沸騰后，再加大火力，直至消化液黑褐色消失呈淡藍(lán)色透明為止。如樣品含脂肪較多時(shí)，應(yīng)適當(dāng)增加硫酸量，用硫酸量少時(shí)，過(guò)多的硫酸鉀會(huì)形成硫酸氫鉀而不與氨作用，導(dǎo)致氨損失。
（5）當(dāng)樣品消化液渾濁或未澄清透明時(shí)，可先將凱氏燒瓶放冷至室溫后，再加入30%的過(guò)氧化氫，然后繼續(xù)加熱消化；
（6）蒸餾裝置要安裝平穩(wěn)、牢固、嚴(yán)密，各連接部分不能漏氣。水蒸氣發(fā)生器裝水不可太滿，加玻璃珠以防爆沸。
（7）蒸餾時(shí)，蒸汽要發(fā)生均勻、充足，不得�；饠嗥�，否則蒸餾瓶?jī)?nèi)壓力降低會(huì)發(fā)生倒吸；避免瓶中的液體發(fā)泡沖出進(jìn)入接收瓶。加堿量要足，動(dòng)作要快，防止氨損失。冷凝管出口一定要浸入吸收液中，防止氨揮發(fā)損失。要保證蒸餾裝置不能漏氣
（8）蒸餾結(jié)束后，應(yīng)先將吸收液離開(kāi)冷凝管口，以免發(fā)生倒吸。判斷是否蒸餾完全，可用pH試紙測(cè)試?yán)淠芸诘睦淠憾_定。
（9）在蒸餾時(shí)反應(yīng)室與外界存在的壓力差，蒸汽可將氨帶出。故蒸餾時(shí)，要保證蒸汽均勻、充足，中間不能停止加熱，防止發(fā)生倒吸；
三常見(jiàn)問(wèn)題解答
一、消化過(guò)程中容易沾壁怎么辦？消化后定氮瓶?jī)?nèi)有黑色殘留物怎么辦？
解答：稱樣時(shí)需要注意切勿使樣品粘附在定氮瓶頸部，避免因樣品未消化完全而造成結(jié)果偏低。消化過(guò)程中如果發(fā)生沾壁在定氮瓶肚上或者定氮瓶肚上有黑色殘留物，可以在消化較完全時(shí)搖動(dòng)定氮瓶，把定氮瓶肚上的黑色物質(zhì)搖洗下來(lái)。搖動(dòng)的方法是取下小漏斗，戴上防燙手套，手掌緊握瓶頸，向前后側(cè)甩，使瓶?jī)?nèi)液體呈半旋轉(zhuǎn)半振蕩狀態(tài)，注意控制力度不要讓液體濺離瓶口。
二、硫酸鉀的作用是催化劑嗎？
解答：硫酸鉀的作用是提高溶液沸點(diǎn)，從而加快有機(jī)物分解。但是不能加入過(guò)多的硫酸鉀，否則會(huì)因?yàn)闇囟冗^(guò)高，使生成的硫酸銨發(fā)生熱分解成氨而造成損失。
三、硫酸銅是否是消化終點(diǎn)以及加堿蒸餾時(shí)的指示劑？
解答：硫酸銅的作用有三個(gè)，分別為：
①催化作用：加速有機(jī)物的氧化分解。
②消化完全的指示劑：使液體呈現(xiàn)藍(lán)綠色澄清透明狀態(tài)。
③蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑：產(chǎn)生褐色沉淀。
四、混合指示劑必須臨用時(shí)混合嗎？
解答：混合指示劑必須臨用時(shí)混合。
五、蒸餾的時(shí)取下錐形瓶需要用洗瓶沖洗嗎？不沖洗會(huì)有誤差嗎？
解答：需要沖洗冷凝管下端以防止產(chǎn)生結(jié)果誤差。蒸餾后移動(dòng)蒸餾液接收瓶,液面離開(kāi)冷凝管下端,再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部,然后取下蒸餾液接收瓶。
六、蒸餾儀器的檢漏如何操作？
解答：可以將蒸餾裝置連接好后，在接口以及瓶塞等可能漏氣的地方滴加少量水，打開(kāi)電爐加熱，觀察有無(wú)氣泡產(chǎn)生。
七、硼酸可以多加嗎？
解答：不可以。按國(guó)標(biāo)的要求正確操作，10mL硼酸足夠。
八、滴定時(shí)消耗了很多鹽酸溶液，能否換濃度高的鹽酸溶液滴定？
解答：不能更改國(guó)標(biāo)給出的滴定液濃度。蛋白質(zhì)含量較高的樣品可以適當(dāng)減少稱樣量，或合理范圍內(nèi)減少吸取消化液的體積V3。
九、空白消耗標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積指的是什么？
解答：試劑空白實(shí)驗(yàn)消耗的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積就是空白體積。
十、同時(shí)有兩種蛋白怎么換算？
解答：同時(shí)含有多種蛋白質(zhì)，且折算系數(shù)不相同時(shí)可以按復(fù)合配方食品換算蛋白質(zhì)系數(shù)。
凱氏定氮儀使用常見(jiàn)問(wèn)題解答
1、 凱氏定氮儀在蒸餾時(shí)翻滾劇烈，會(huì)對(duì)操作者構(gòu)成危險(xiǎn)嗎？
答：一般不會(huì)，凱氏定氮儀在蒸餾時(shí)翻滾劇烈，是水蒸氣大量進(jìn)入消化管液體翻滾，并非劇烈反應(yīng)造成；而且儀器有超壓保護(hù)裝置，可以保持管路內(nèi)部常壓，避免危險(xiǎn)。
2、 凱氏定氮儀工作中對(duì)水質(zhì)有什么要求？
答：凱氏定氮儀的蒸餾水桶內(nèi)要裝蒸餾水或純水，機(jī)器長(zhǎng)期不用要將蒸餾器里水放掉。
3、 凱氏定氮儀開(kāi)機(jī)沒(méi)聲音是怎么回事？
答：凱氏定氮儀開(kāi)機(jī)沒(méi)聲音，如果機(jī)器電源開(kāi)關(guān)內(nèi)紅燈亮，說(shuō)明是定氮儀內(nèi)保險(xiǎn)管燒斷了，保險(xiǎn)管位置在機(jī)器內(nèi)部靠近電源開(kāi)關(guān)接口5公分處黑色殼子內(nèi)。
4、 凱氏定氮儀開(kāi)機(jī)后蒸餾器內(nèi)不加水怎么解決？
答：開(kāi)機(jī)半分鐘后檢查蒸餾水桶是否漏氣，能被氣充鼓是正常；檢查蒸餾水桶內(nèi)水位是否超過(guò)三分之一，不夠補(bǔ)齊；檢查蒸餾水桶的位置，低于放置儀器的臺(tái)面，壓力不夠，加不上水；檢查蒸餾水桶進(jìn)氣、進(jìn)液管是否接錯(cuò)，接錯(cuò)桶內(nèi)會(huì)產(chǎn)生氣泡并發(fā)出聲響；檢查排水閥，應(yīng)呈關(guān)閉狀態(tài)。
5、 凱氏定氮儀蒸鍋不加熱，不能產(chǎn)生蒸氣，為什么？
答：如果機(jī)器能正常加堿，不能加熱出蒸氣，判定加熱絲可能燒壞了，可拿萬(wàn)用表量一下加熱絲正負(fù)極，不通可確定加熱絲損壞，換新加熱絲。
如果機(jī)器不能正常加堿，開(kāi)機(jī)后又沒(méi)有任何聲音，判斷是保險(xiǎn)絲燒斷了，保險(xiǎn)管位置在機(jī)器內(nèi)部靠近電源開(kāi)關(guān)接口5公分處黑色殼子內(nèi)。
6、 凱氏定氮儀工作時(shí)聲音大，是否正常？
答：屬于正�，F(xiàn)象，這是機(jī)器內(nèi)部氣泵工作的聲音。
7、 凱氏定氮儀工作中不能加堿、加堿沒(méi)有聲音，為什么？
答：檢查堿桶是否漏氣，被氣充鼓機(jī)器才能正常工作；儀器使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，堿管內(nèi)部會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶，導(dǎo)致加液時(shí)流速降低，沒(méi)有聲音。
8、 定氮儀在工作時(shí)，從頂部冒出類(lèi)似煙的氣體，怎么回事？
答：檢查冷卻水進(jìn)水的水龍頭是否打開(kāi)，冷卻水關(guān)閉或者水量小都會(huì)導(dǎo)致消化管出來(lái)的蒸氣不能被冷凝，從機(jī)器里冒出來(lái)的水蒸氣，看起來(lái)類(lèi)似煙。
9、 定氮儀使用中發(fā)現(xiàn)消化管進(jìn)滿水，怎么解決？
答：定氮儀使用中發(fā)生消化管進(jìn)滿水，是由于機(jī)器控制水位器導(dǎo)電性降低造成的，解決辦法：打開(kāi)水位器取出探針用砂紙打磨，去掉氧化層；在蒸餾水桶里加入3-5克實(shí)驗(yàn)室用氯化鈉，搖勻溶解。
10、定氮儀使用中發(fā)生蒸餾器、水位器進(jìn)滿水，硼酸吸收液容器中進(jìn)水，怎么解決？
答：是機(jī)器控制水位器導(dǎo)電性降低造成的，解決辦法：打開(kāi)水位器取出探針用砂紙打磨，去掉氧化層；在蒸餾水桶里加入3-5克實(shí)驗(yàn)室用氯化鈉，搖勻溶解。
11、定氮儀使用中消化管中白色管子發(fā)生倒吸，怎樣解決？
答: 儀器停止工作（蒸餾器停止加熱），氣閥未能及時(shí)關(guān)閉，會(huì)產(chǎn)生倒吸現(xiàn)象，可在白色管子上扎一些小孔。氣閥損壞，不能關(guān)閉，也會(huì)倒吸。
12、定氮儀工作中隔3-5秒鐘會(huì)發(fā)出聲響，是否正常？
答：這種聲響屬于正�，F(xiàn)象，儀器工作狀態(tài)下，蒸餾器會(huì)不斷加熱產(chǎn)生水蒸汽而消耗水，儀器會(huì)自動(dòng)打開(kāi)水閥進(jìn)行補(bǔ)水，聲響就是水閥打開(kāi)、關(guān)閉的聲音，屬于正常現(xiàn)象。
注：
1、每次使用儀器前，應(yīng)讓儀器空煮一次，清洗儀器的內(nèi)部管路。
2、儀器使用完畢，應(yīng)將其中一只桶的桶蓋打開(kāi)，將桶內(nèi)的氣體排出，延長(zhǎng)附件的使用壽命（3個(gè)或2個(gè)桶串聯(lián)，排氣時(shí)只打開(kāi)一只桶蓋即可）。
