食品伙伴網(wǎng)服務(wù)號
當(dāng)前位置: 首頁 » 檢驗技術(shù) » 培訓(xùn)資料及講義 » 正文

病毒感染的實驗室診斷

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-08-15  來源:實驗室資訊網(wǎng)
核心提示: 病毒感染的實驗室檢查包括病毒分離與鑒定、病毒核酸與抗原的直接檢出以及特異性抗體的檢測。臨床醫(yī)師根據(jù)流行病學(xué)資料,疾病的
      病毒感染的實驗室檢查包括病毒分離與鑒定、病毒核酸與抗原的直接檢出以及特異性抗體的檢測。臨床醫(yī)師根據(jù)流行病學(xué)資料,疾病的癥狀與體征綜合判斷可能為何種病毒感染,留取適宜的標(biāo)本送檢。

一、檢材的采集與送檢

病毒性疾病通常采集血液、鼻咽分泌液、咯痰、糞便、腦脊液、皰疹內(nèi)容物、活檢組織或尸檢組織等。

供分離病毒、檢出核酸及抗原的標(biāo)本的,要求:

(一)盡早采取 在發(fā)病初期(急性期)采取,較易檢出病毒,越遲陽性率越低。

(二)部位適宜 由感染部位采取,如呼吸道感染采取鼻咽洗漱液或咯痰;腸道感染采取糞便;腦內(nèi)感染采取腦脊液;皮膚感染采取病灶組織;有病毒血癥時采取血液。

(三)冷藏速送 病毒離活體后在室溫下很易死亡,故采得檢材應(yīng)盡快送檢。若距離實驗室較遠(yuǎn),應(yīng)將檢材放入裝有冰塊或干冰的空器內(nèi)送檢。病變組織則應(yīng)保存于50%的甘油緩沖鹽水中。污染檢材,如鼻咽分泌液、糞便等應(yīng)加入青霉素、鏈霉素或慶大毒素等,以免雜菌污染細(xì)胞或雞胚,而影響病毒分離。

檢測特異性抗體需要采取急性期與恢復(fù)期雙份血清,第一份盡可能在發(fā)病后立即采取,第二份在發(fā)病后2~3周采取。血清標(biāo)本放4℃-20℃保存,試驗前血清標(biāo)本以56℃30分鐘處理去除非特異性物質(zhì)及補(bǔ)體。無菌性腦炎患者也可取腦脊液檢測特異性lgM。

表80-1 病毒檢材采集與檢驗結(jié)果的關(guān)系

 

 

 

 

采取標(biāo)本的時期

檢查病毒及其成分

測定抗體

潛伏期及前驅(qū)期

剛發(fā)病或急性期

恢復(fù)期及康復(fù)期

較難查見

最多查見

很難查見

未增多

未增多或增多不明顯

明顯增多(常超過4倍)

表80-2 供病毒分離的檢材

 

 

 

 

臨床表現(xiàn)

常見病毒 幫助診斷有用的檢材

呼吸道感染

腺病毒

巨細(xì)胞病毒

流感病毒

副流感病毒

呼腸孤病毒

合胞病毒

咽試、肛拭

咽試或含漱液、尿液

咽拭或含漱液

咽拭含漱液

咽拭、糞便或肛拭

咽拭或含漱液、鼻咽洗液

出疹疾病

柯薩奇病毒

巨細(xì)胞病毒

?刹《

EB病毒

單純皰疹病毒

麻疹病毒

風(fēng)疹病毒

水痘帶狀皰疹病毒

糞便或肛拭、咽拭

咽拭或含漱液、尿液

糞便或肛拭、咽拭

咽拭或含漱液

病灶棉拭或吸取液、咽拭

咽拭或含漱液、尿液

咽洗液、鼻咽拭

病灶棉拭或吸取液、咽拭

腦炎

蟲媒病毒

單純皰疹病毒

麻疹病毒

脊髓灰質(zhì)炎病毒

血液、腦脊液

腦活檢、腦脊液、皰疹棉拭或吸取液

腦脊液、咽拭或含漱液、尿液

糞便或肛拭、咽拭、腦脊液

無菌性腦膜炎

柯薩奇病毒

?刹《

腮腺炎病毒

腦脊髓液、糞便或肛拭、咽拭

腦脊液、糞便或肛拭、咽拭

腦脊髓液、口頰粘膜棉拭

失天或新生兒感染

巨細(xì)胞病毒

風(fēng)疹病毒

單純皰疹病毒

尿液、咽拭或含漱液

咽拭或含漱液、尿液

病灶棉拭或吸取液、回拭

眼部感染

腺病毒

單純皰疹病毒

結(jié)膜棉拭、咽拭、肛拭

結(jié)膜棉拭、病灶棉拭或吸取液、咽拭

其它感染

巨細(xì)胞包涵體疾病

單核細(xì)胞增多綜合征

心包炎、心肌炎

巨細(xì)胞病毒

巨細(xì)胞病毒

EB病毒

柯薩奇B病毒

埃可病毒

尿液、咽拭

尿液、咽拭

咽拭或洗液

心包液、糞便、咽拭

心包液、糞便、咽拭

二、病毒的分離與鑒定

(一)病毒的分離

病毒分離的一般程序見表80-3。

表80-3 病毒分離的一般程序

 

 

細(xì)胞系名稱

來源

二倍體細(xì)胞系

HDCS

MRC-9

WI-38

傳代細(xì)胞系

Hela

Hep-2

Vero

BHK

人胚肺細(xì)胞

人宮頸癌細(xì)胞

人上皮細(xì)胞

猴腎細(xì)胞

地鼠腎細(xì)胞

 

 

 

 

 

淋巴細(xì)胞培養(yǎng) (Lymphocyte culture) 正常成熟的淋巴細(xì)胞不經(jīng)特殊處理不能在體外傳代培養(yǎng)。然而EBV感染的B淋巴細(xì)胞卻能在體外持續(xù)傳代,這是病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的例證,也是分離出EBV的標(biāo)志。T淋巴細(xì)胞在加入T細(xì)胞生長因子(IL-2)后可在體外培養(yǎng),為研究人類逆轉(zhuǎn)錄病毒(HIV、HTLV)提供了條件,HIV在T淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 物中增殖形成多核巨細(xì)胞。

 

2.動物試驗 這是最原始的病毒分離培養(yǎng)方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接種途徑根據(jù)各病毒對組織的親嗜性而定,可接種鼻內(nèi)、皮內(nèi)、腦內(nèi)、皮下、腹腔或靜脈,例如嗜神經(jīng)病毒(腦炎病毒)接種鼠腦內(nèi),柯薩奇病毒接種乳鼠(一周齡)腹腔或腦內(nèi)。接種后逐日觀察實驗動物發(fā)病情況,如有死亡,則取病變組織剪碎,研磨均勻,制成懸液,繼續(xù)傳代,并作鑒定。

 

3.雞胚培養(yǎng) 用受精孵化的活雞胚培養(yǎng)病毒比用動物更加經(jīng)濟(jì)簡便。根據(jù)病毒的特性可分別接種在雞胚絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黃囊、腦內(nèi)或靜脈內(nèi),如有病毒增殖,則雞胚發(fā)生異常變化或羊水、尿囊液出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象,常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分離培養(yǎng);但很多病毒在雞胚中不生長。

 

(二)分離病毒的鑒定

1.病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指征

(1)細(xì)胞致病作用(Cytopathogenic effect,CPE) 病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖引起細(xì)胞退形性變,表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡和脫落。某些病毒產(chǎn)生特征性CPE,普通光學(xué)倒置顯微鏡下可觀察上述細(xì)胞病變,結(jié)合臨床表現(xiàn)可做出預(yù)測性診斷(表80-4)。免疫熒光(IF)法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點,細(xì)胞內(nèi)的病毒或抗原可被熒光素標(biāo)記的特異性抗體著色,在熒光顯微鏡下可見斑點狀黃綠色熒光,根據(jù)所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。

 

表80-4 病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指征

 

 

 

 

 

 

病毒

增殖指征

CPE病毒

小RNA病毒

單純皰疹病毒

腺病毒

副粘病毒

HIV

非CPE病毒

正粘病毒

副粘病毒

風(fēng)疹病毒

鼻病毒

 

細(xì)胞園縮、單層破壞

細(xì)胞腫大變園

細(xì)胞變園堆積成葡萄狀

多核巨細(xì)胞(合胞體)

紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象

干擾并阻止其他病毒(如ECHO病毒)的細(xì)胞致病作用

(2)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象(Hemadsorption phenomenon) 流感病毒和某些副粘病毒感染細(xì)胞后24-48小時,以細(xì)胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素,能吸附豚鼠、雞等動物及人的紅細(xì)胞,發(fā)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。若加入相應(yīng)的抗血清,可中和病毒血凝素、抑制紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的發(fā)生,稱為紅細(xì)胞吸附抑制試驗。這一現(xiàn)象不僅可作為這類病毒增殖的指征,還可作為初步鑒定。

 

(3)干擾現(xiàn)象 (Interference phenomenon) 一種病毒感染細(xì)胞后可以干擾另一種病毒在該細(xì)胞中的增殖,這種現(xiàn)象叫干擾現(xiàn)象。前者為不產(chǎn)生CPE的病毒(如風(fēng)疹病毒)但能干擾以后進(jìn)入的病毒(如ECHO病毒)增殖,使后者進(jìn)入宿主細(xì)胞不再生產(chǎn)CPE。

2.病毒感染性的定量測定

空斑形成單位 (Plaque-forming unit ,PFU) 測定 這是一種測定病毒感染性比較準(zhǔn)確的方法。將適當(dāng)濃度的病毒懸液接種到生長單層細(xì)胞的玻璃平皿或扁瓶中,當(dāng)病毒吸附于細(xì)胞上后,再在其上復(fù)蓋一層溶化的半固體營養(yǎng)瓊脂層,待凝固后,孵育培養(yǎng)。當(dāng)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖后,每一個感染性病 毒顆粒在單層細(xì)胞中產(chǎn)生一個局限性的感染細(xì)胞病灶,病灶逐漸擴(kuò)大,若用中性紅等活性染料著色,在紅色的的背景中顯出沒有著色的“空斑”,清楚可見。由于每個空斑由單個病毒顆粒復(fù)制形成,所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位(PFU)來表示。

(2)50%致死量(LD50)或50%組織細(xì)胞感染量(TCID50)的測定 本法可估計所含病毒的感染量。方法是測定病毒感染雞胚,易感動物或組織培養(yǎng)后,引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量,即將病毒懸液作10倍連續(xù)稀釋,接種于上述雞胚,易感動物或組織培養(yǎng)中,經(jīng)一定時間后,觀察細(xì)胞或雞胚病變,如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性,或易感動物發(fā)病而死亡等,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)方法計算出50%感染量或50%組織細(xì)胞感染量,可獲得比較準(zhǔn)確的病毒感染性滴度。

3.病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察 病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后,借助磷鎢酸負(fù)染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒,根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學(xué)技術(shù)分析病毒核酸組成、基因組 織構(gòu)、序列同源性比較加以鑒定。

4.血清學(xué)鑒定 用已知的診斷血清來鑒定。補(bǔ)體結(jié)合試驗可鑒定病毒科屬;中和試驗或血凝搗蛋制試驗可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株,應(yīng)結(jié)合臨床癥狀,檢材來源及流行季節(jié)等加以綜合分析,并應(yīng)注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆,須用病人急性期與恢復(fù)期雙份血清作血清學(xué)試驗,血清抗體滴度有≥4倍以上增高,才有意義。

三、病毒核酸及抗原的直接檢出

(一)直接檢出病毒核酸

1.核酸雜交(Nucleic acid hybridization) -臨床病毒學(xué)中報速診斷方法通常是檢測標(biāo)本中的病毒抗原,然而核酸分子雜交具有高度敏感性和特異性,斑點雜交 (Dot hybridization) 廣泛用于檢測呼吸道標(biāo)本,尿標(biāo)本中的病毒核酸。標(biāo)本滴加到硝酸纖維素膜上,病毒DNA結(jié)合到膜上,在原位進(jìn)行鹼變性處理后,有放射標(biāo)記的已知病毒DNA片段雜并,兩條單股核酸按鹼基到補(bǔ)原則結(jié)合成雙股,經(jīng)放射自顯影,陽性結(jié)果出現(xiàn)斑點狀雜交信號。含輪狀病毒的糞便標(biāo)本經(jīng)熱變性處理,點到膜上,使用輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄的放射標(biāo)記探針做斑點雜交,敏感性高于ELISA。腸道病毒也可用互補(bǔ)的DNA探針做斑點雜交。

目前核酸分子雜交不但用來檢測急性病 人標(biāo)本中的病毒DNA,也用于檢測不易分離培養(yǎng)的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標(biāo)本中的病毒DNA。

2.多聚酶鏈反應(yīng) (Polymerase chain reaction, PCR) 一種體外基因擴(kuò)增法。先將待檢標(biāo)本DNA熱變性為單股DNA做為模板,加一對人工合成的與模板DNA兩端各20個鹼基互補(bǔ)的引物,在耐熱DNA多聚酶作用下,使四種脫氧核苷按模板3�端引物向5�端延伸DNA鏈,經(jīng)20~40個循環(huán),可使1個拷貝的核酸擴(kuò)增至106以上,經(jīng)瓊脂糖電泳,可見到溴化乙錠染色的核酸條帶,擴(kuò)增片段的大小取決于兩引物的間距。此法較核酸雜交敏感、快速,已用于肝炎、AIDS、皰疹病毒感染診斷,尤其適用于不易分離培養(yǎng)及含量極少的病毒標(biāo)本,有較大應(yīng)用前景。

(二)直接檢測病毒抗原

1.免疫熒光(IF)技術(shù) 如前所述IF可用于細(xì)胞培養(yǎng) 病毒的鑒定,也適用檢測臨床標(biāo)本中病毒抗原,具有快速、特異的優(yōu)點。直接免疫熒光技術(shù)是用熒光素直接標(biāo)記特異性抗體,檢測病毒抗原;間接免疫熒光技術(shù)是先用特異性抗體與標(biāo)本中抗原結(jié)合,再用熒光素標(biāo)記的抗體與特異性抗體結(jié)合,從而間接識別抗原?扇⊙屎砻撀浼(xì)胞,檢測呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原;取病灶刮片或腦活檢標(biāo)本,檢測單純皰疹病毒抗原;取尿沉渣檢測巨細(xì)胞病毒抗原等。近年來使用單克隆抗體大大提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。

2.免疫酶法(IEA) 原理與應(yīng)用范圍同免疫熒光技術(shù),IEA是用酶(通常是過氧化物酶)取代熒光素標(biāo)記抗體,酶催化底物形成有色產(chǎn)物,在普通光學(xué)顯微鏡下清晰可見,不需熒光顯微鏡,便于推廣使用。

3.放射免疫測定法(RIA) 有競爭RIA和因相RNA二種方法。競急RIA是同位素標(biāo)記的已知抗原與標(biāo)本中未標(biāo)記的待檢抗原競爭性結(jié)合特異性抗體的試驗,將形成的復(fù)合物分離出來,用放射免疫檢測儀測定放射活性,同時與系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原測定結(jié)果進(jìn)行比較,確定出待檢抗原的濃度。因相RIA是用特異性抗體包被因相以捕獲標(biāo)本中的抗原,然后加入放射性標(biāo)記的特異性抗體與抗原結(jié)合,測定放射活性,得知抗原的量。RIA是最敏感的方法,已用于測定糞便中甲肝病毒、輪狀病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。

4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 先將特異性抗體包被(吸附)到塑料微培板孔中以捕捉標(biāo)本中相應(yīng)抗原,然后加入酶標(biāo)特異性抗體,相應(yīng)抗原被夾在抗體之間,當(dāng)加入酶的底物后顯色,顯色程度直接反映了標(biāo)本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA,又不接觸放射性物質(zhì),已被多數(shù)實驗室采用。

此外,對難以分離培養(yǎng),形態(tài)特殊且病毒數(shù)量較多的標(biāo)本,可用電鏡或免疫電鏡法直接觀察,是一種快速診斷與鑒定病毒的方法,如輪狀病毒、乙肝病毒。

四、特異性抗體的檢測特異性抗體的檢測

病毒感染后通常誘發(fā)針對病毒一種或多種抗原免疫應(yīng)答,特異性抗體效價升高或lgM抗體出現(xiàn)有輔助臨床診斷的價值。

(一)補(bǔ)體結(jié)合試驗(CF) CF分二個階段:1.抗原與抗體(一個為已知,一個為待檢)混合,加入定量補(bǔ)體,若抗原與抗體相對應(yīng),則補(bǔ)體被消耗;2.在上述混合物中加入溶血素致敏的綿羊紅細(xì)胞,若補(bǔ)本已與抗原抗體復(fù)合物完全結(jié)合,沒有剩補(bǔ)體存在,那么綿羊紅細(xì)胞不會溶血,結(jié)果為陽性,說明待檢標(biāo)本中有特異性存在,出現(xiàn)陽性結(jié)果時血清標(biāo)本最高稀釋度為抗體的效價。反之為陰性結(jié)果。由于補(bǔ)體結(jié)合抗體產(chǎn)生早,消失快,適于診斷病毒近期感染。(表80-5)。

 

 

 

 

 

 

取血時期

血清稀釋倍數(shù)及試驗結(jié)果

抗體效價

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

發(fā)病2~3內(nèi)血清

發(fā)病2~3周后血清

+

 

 

+

+

 

 

+

+

+

-

+

-

+

-

-

-

-

 

1:8

 

1:32*

*此例的抗體效價升高4倍,有診斷意義。

(二)中和試驗(NT) 在活體或活細(xì)胞內(nèi)測定病毒被特異性抗體中和、而失去致病力的試驗。試驗時:①須先測出病毒的半數(shù)致死量(LD50)或半數(shù)感染量(ID50);②隨即取活病毒與被試血清按不同比例混合,放置1~2小時讓其充分中和;③將病毒與血清混合液注入各組動物、雞胚或組織細(xì)胞培養(yǎng)管內(nèi)培養(yǎng);④根據(jù)動物、雞胚死亡數(shù)或細(xì)胞病變的管數(shù),計算出百分比(%),然后再計算這些試驗對象中的半數(shù)免于死亡或免于致病所需要的最少量血清(或最大量的病毒),就是該血清的中和抗體效價(稱為50%終點的中和效價)。診斷病毒性疾病時,須取病人雙份血清同時做對比試驗,病后血清的中和抗體效價也必須超過病初血清4倍以上,才能確診(表23-6)。用此法鑒定病毒時,須將病毒分別與免疫血清及血清正常血清(對照)混合做對比試驗,免疫血清比正常血清多中和50~100倍劑量的病毒,才能斷定是該病毒。、

 

表80-6 病人雙份血清的病毒中和試驗結(jié)果(組織細(xì)胞培養(yǎng)的中和試驗)

 

 

 

 

試驗病毒(用100個TCLD50)①

病人血清(取血時期)

活病毒+稀釋血清對細(xì)胞致、

50%終點血清中和抗體效價 ③ (血清稀釋倍數(shù))

1:5

1:10

1:20

1:40

1:80

1:160

 

甲病毒

病初(2日)

0000

00++

++++

++++

++++

++++

10(1:10)

病后(20日)

0000

0000

0000

0000

00++

++++

80(1:80

說明:
①TCID50=組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量。

②每種稀釋度接種4支組織細(xì)胞培養(yǎng)管;0=未出現(xiàn)細(xì)胞致病作用;+=出現(xiàn)細(xì)胞致病作用。

③此例的病后血清中和抗體效價比病初血清增高8倍,有診斷意義。

病毒中和抗體的特異性高,持續(xù)時間久,以往受顯性或隱性感染后,血中可長期存在中和抗體,所以適用于流行病學(xué)調(diào)查或人群免疫水平研究,但因試驗方法繁雜,耗用動物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)較多,故一般不作常規(guī)使用。

(三)血凝抑制試驗(Hemagglutination inhibition test,HIT)某些病毒(流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、腦炎病毒等)能凝集紅細(xì)胞,而抗體與這些病毒結(jié)合后卻能阻止它們的凝集,若雙份血清有≥4倍以上滴度增高,也可用于診斷這類病毒感染。本法簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、特異性高,常用于流行病學(xué)調(diào)查等。

(四)lgM捕捉ELISA 特異性lgM出現(xiàn)于病毒感染的早期或病毒感染的活動期,因此可從急性期病人單份血清中檢出特異性lgM,這是病毒感染實驗室早期診斷的可靠方法。實驗中先用u鏈血清包被微培板孔,用以捕捉血清標(biāo)本中的lgM類抗體,再加入特異性病 毒抗原及酶標(biāo)抗體以證實特異性lgM的存在,F(xiàn)已廣泛用于病毒病的早期診斷。在先天性感染中,lgM檢測有特殊意義,因lgM不能通過胎盤,新生兒血清中發(fā)現(xiàn)抗病毒lgM提示為宮內(nèi)感染。

 
編輯:songjiajie2010

 
分享:
關(guān)鍵詞: 病毒感染 實驗室診斷
[ 網(wǎng)刊訂閱 ]  [ 檢驗技術(shù)搜索 ]  [ ]  [ 告訴好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 關(guān)閉窗口 ] [ 返回頂部 ]
 

 
 
推薦圖文
推薦檢驗技術(shù)
點擊排行
檢驗技術(shù)
 
 
Processed in 0.093 second(s), 13 queries, Memory 0.95 M