【實驗原理】

 

聚酰胺薄膜層析是60年代以后發(fā)展起來的一種新的層析方法，特別適用于氨基酸及其衍生物的分析。具有靈敏度高、分辨率強、操作方便快捷等特點。

聚酰胺是一類化學纖維素原料，即錦綸（尼龍）。由乙二酸和乙二胺聚合而成的，稱錦綸66。

 

由于分子中含有大量的酰胺基團，故稱聚酰胺。聚酰胺薄膜是在滌綸片基上涂上一層錦綸制成的。聚酰胺對許多極性物質有吸附作用，這是由于聚酰胺的-C=O和-NH- 能與被分離物質的一定基團形成H鍵。如酚類（黃酮類、鞣質）和酸類（氨基酸、核苷酸）能以其羥基與酰胺鍵的羰基形成H鍵。在層析過程中，當樣品隨流動相通過聚酰胺薄膜時，由于聚酰胺與各極性分子產生H鍵吸附能力的強弱不同，從而可將樣品中各成分分離。

物質分離后，層析點在圖譜上的位置，即在濾紙上的移動速率，用Rf來表示。

 

在一定條件下，每個物質都有特定的Rf值，因此，用Rf可鑒定不同的物質。

無色物質的層析圖譜可用光譜法（紫外照射）或顯色法鑒定。氨基酸層析圖譜常用茚三酮作顯色劑。本實驗利用單向上行層析法鑒定氨基酸。

【實驗試劑和器材】

(一) 試劑

1. 氨基酸標準液(10mg/ml)：三種氨基酸是賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸，分別配成上述濃度的溶液。

2. 氨基酸混合液（每種氨基酸5mg/ml）

3. 展層劑：正丁醇：12％氨水：95％乙醇＝13: 3: 3（V/ V）

4. 0.1%茚三酮－正丁醇液。

(二) 器材

聚酰胺薄膜，毛細管，層析裝置，電吹風機，噴霧器， 塑料手套等。

【實驗方法】

(一) 薄膜的剪裁

取薄膜（7cm×10cm）一張，在紙的一端距邊緣2cm處用鉛筆輕輕劃一直線，在此直線上每隔1厘米作一記號為點樣處（外側兩點距邊緣2cm）。

(二) 點樣

氨基酸的點樣量以5ul為宜。點樣時，用毛細管吸取氨基酸樣品，與薄膜垂直方向輕輕碰點樣處，每點在紙上擴散的直徑最大不超過2mm。點樣過程中，必須在第一點樣品干后再點第二滴。為加快樣品干燥，可用吹風機吹干，注意溫度不宜過高，以免損壞氨基酸。

(三) 展層

在層析缸中放一個小培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿中倒入適量展層劑，將點好樣品的薄膜斜立于培養(yǎng)皿中（注意點樣的一端在下），展層劑的液面需低于點樣線１厘米。當溶劑前沿距上邊緣１厘米處時，取出膜片，立即用筆標出溶劑前沿的位置，自然干燥或用吹風機吹干。

（四）定性鑒定

用0.1％茚三酮－正丁醇液在薄膜的一面均勻噴霧。晾干后，用一直尺測量每一顯色斑點中心與原點的距離和原點到溶劑前沿的距離，求其比值，即得各種氨基酸的Rf值。

在層析圖譜上，對比標準氨基酸的位置（Rf值），確定氨基酸混合樣中氨基酸的種

類及位置。

【注意事項】

1. 選用合適、潔凈的薄膜。勿用手直接接觸薄膜。

2. 點樣斑點不能太大（其直徑應小于2mm）。吹風機溫度不宜過高，否則斑點變黃。

3. 根據(jù)一定目的、要求，選擇合適的溶劑系統(tǒng)。