5.1. 微生物菌種保藏
在發(fā)酵工業(yè)中,具有良好性狀的生產(chǎn)菌種的獲得十分不容易,如何利用優(yōu)良的微生物菌種保藏技術(shù),使菌種經(jīng)長期保藏后不但存活健在,而且保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型,特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力,即很少發(fā)生突變,這對于菌種極為重要。
微生物菌種保藏技術(shù)很多,但原理基本一致,即采用低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)、添加保護(hù)劑或酸度中和劑等方法,挑選優(yōu)良純種,最好是它們的休眠體,使微生物生長在代謝不活潑,生長受抑制的環(huán)境中。具體常用的方法有:蒸餾水懸浮或斜面?zhèn)鞔2;干?載體保藏或冷凍干燥保藏;超低溫或在液氮中冷凍保藏等方法。
5.1.1. 蒸餾水懸浮法
這是一種最簡單的菌種保藏方法,只要將菌種懸浮于無菌蒸餾水中,將容器封好口,于10℃保藏即可達(dá)到目的。好氣性細(xì)菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面?zhèn)鞔2?nbsp;
斜面?zhèn)鞔2胤椒ㄊ菍⒕N定期在新鮮瓊脂斜面培養(yǎng)基上、液體培養(yǎng)基中或穿刺培養(yǎng),然后在低溫條件下保存。它可用于實(shí)驗(yàn)室中各類微生物的保藏,此法簡單易行,且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變、菌種退化、菌株污染等不良現(xiàn)象。因此要求最好在基本培養(yǎng)基上傳代,目的是能淘汰突變株,同時(shí)轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平。斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于5℃保藏,以防止培養(yǎng)基脫水并降低代謝活性。此方法一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長期保藏,一般保存時(shí)間為3~6個(gè)月。如放線菌于4~6℃保存,每3個(gè)月移接一次;酵母菌于4~6℃保存,每4~6個(gè)月移接一次;霉菌于4~6℃保存,每6個(gè)月移接一次。
5.1.3. 礦物油中浸沒保藏
此方法簡便有效,可用于絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。是將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物或穿刺培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下或冰箱中保藏,操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長,然后注入經(jīng)160℃干熱滅菌1~2h或濕熱滅菌后120℃烘去水分的礦物油,礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜,并以橡皮塞代替棉塞封口,這樣可使菌種保藏時(shí)間延長至1~2年。以液體石蠟作為保藏方法時(shí),應(yīng)對需保藏的菌株預(yù)先作試驗(yàn),因?yàn)槟承┚耆缃湍、霉菌、?xì)菌等能利用石蠟為碳源,還有些菌株對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏,為了預(yù)防不測,一般保藏菌株 2~3年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn)。
5.1.4. 干燥-載體保藏
此法適用于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物的保藏。是將菌種接種于適當(dāng)?shù)妮d體上,如河砂、土壤、硅膠、濾紙及麩皮等,以保藏菌種。以沙土保藏用得較多,制備方法為:將河砂經(jīng)24目過篩后用10%~20%鹽酸浸泡3~4 h,以除去其中所含的有機(jī)物,用水漂洗至中性,烘干,然后裝入高度約1cm的河沙于小試管中,121℃間歇滅菌3次。用無菌吸管將孢子懸液滴入砂粒小管中,經(jīng)真空干燥8 h,于常溫或低溫下保藏均可,保存期為1~10年。土壤法以土壤代替砂粒,不需酸洗,經(jīng)風(fēng)干、粉碎,然后同法過篩、滅菌即可。一般細(xì)菌芽孢常用砂管保藏,霉菌的孢子多用麩皮管保藏。
5.1.5. 冷凍保藏
冷凍保藏是指將菌種于-20℃以下的溫度保藏, 冷凍保藏為微生物菌種保藏非常有效的方法。通過冷凍,使微生物代謝活動(dòng)停止。一般而言,冷凍溫度愈低,效果愈好。為了保藏的結(jié)果更加令人滿意,通常在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑;同時(shí)還要認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速度。冷凍保藏的缺點(diǎn)是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。
普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃):將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上,待生長適度后,將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好,于冰箱的冷藏室中貯藏,或于溫度范圍在-5~20℃的普通冰箱中保存;蛘邔⒁后w培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分別接到試管或指管內(nèi),嚴(yán)格密封后,同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力 1~2年。應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。這一方法雖簡便易行,但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。
超低溫冷凍保藏技術(shù):要求長期保藏的微生物菌種,一般都應(yīng)在-60℃以下的超低溫冷藏柜中進(jìn)行保藏。超低溫冷凍保藏的一般方法是:先離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞,再用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞,然后加入等體積的20%甘油或10%二甲亞砜冷凍保護(hù)劑,混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中,于-70℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1~2℃/ min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。
液氮冷凍保藏技術(shù):近年來,大量有特殊意義和特征的高等動(dòng)、植物細(xì)胞能夠在液氮中長期保藏,并發(fā)現(xiàn)在液氮中保藏的菌種的存活率遠(yuǎn)比其他保藏方法高且回復(fù)突變的發(fā)生率極低。液氮保藏巳成為工業(yè)微生物菌種保藏的最好方法。具體方法是:把細(xì)胞懸浮于一定的分散劑中或是把在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的菌種直接進(jìn)行液體冷凍,然后移至液氮(-196℃)或其蒸汽相中(-l56℃)保藏。進(jìn)行液氮冷凍保藏時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制致冷速度。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟是先制備冷凍保藏菌種的細(xì)胞懸液,分裝0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶,玻璃安瓿用酒精噴燈封口。然后以1.2℃/min的致冷速度降溫,直到溫度達(dá)到相對溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30℃)。待細(xì)胞凍結(jié)后,將致冷速度降為1℃/min,直到溫度達(dá)到-50℃,將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相 (-156℃)中保存。如果無控速冷凍機(jī),則一般可用如下方法代替:將安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷凍4h,然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷凍保藏中,最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油,最終使用濃度一般為甘油10%、二甲亞砜5%。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌,而二甲亞砜最好為過濾滅菌。
5.1.6. 真空凍干保藏
真空冷凍干燥的基本方法是先將菌種培養(yǎng)到最大穩(wěn)定期后,一般培養(yǎng)放線菌和絲狀真菌約需7~10天,培養(yǎng)細(xì)菌約需24~28小時(shí),培養(yǎng)酵母約需3天。然后混懸于含有保護(hù)劑的溶液中,保護(hù)劑常選用脫脂乳、蔗糖、動(dòng)物血清、谷氨酸鈉等,菌液濃度為109~1019個(gè)/ml,取0.1~0.2ml菌懸液置于安瓿管中冷凍,再于減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華至1%~5%,使培養(yǎng)物干燥。最后將管口熔封,保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一,大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏,便于運(yùn)輸。但操作過程復(fù)雜,并要求一定的設(shè)備條件。
5.1.7. 寄主保藏
適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的動(dòng)植物病原菌和病毒。
5.1.8. 基因工程菌的保藏
隨著基因工程的不斷發(fā)展,越來越多的基因工程菌需要得到合理的保藏,由于它們的載體質(zhì)粒等所攜帶的外源DNA片段的遺傳性狀不太穩(wěn)定、且其外源質(zhì)粒復(fù)制子很容易丟失。另外,對于宿主細(xì)胞質(zhì);蛲ǔ樯L非必需,一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí),生長速度會(huì)加快。而由質(zhì)粒編碼的抗生素抗性在富集含此類質(zhì)粒的細(xì)胞群體時(shí)極為有用。當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí),抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí),抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。由此看來基因工程菌最好應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。例如,質(zhì)粒pBR322。它除了能將外源DNA 輸入E.coli細(xì)胞外,還賦予E.coli細(xì)胞Ampr和Tetr。如果在培養(yǎng)基中加入Amp和Tet,則培養(yǎng)時(shí)可選擇出含pBR322質(zhì)粒的細(xì)胞。
5.1.9. 菌種保藏機(jī)構(gòu)
1979年7月,我國成立了中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)(CCCCM),委托中國科學(xué)院負(fù)責(zé)全國菌種保藏管理業(yè)務(wù),并確定了與普通、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學(xué)、抗生素和獸醫(yī)等微生物學(xué)有關(guān)的六個(gè)菌種保藏管理中心。各保藏管理中心從事應(yīng)用微生物各學(xué)科的微生物菌種的收集、保藏、管理、供應(yīng)和交流。以便更好地利用微生物資源為我國的經(jīng)濟(jì)建設(shè)、科學(xué)研究和教育事業(yè)服務(wù)。
(一)中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)組織系統(tǒng):
中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)辦事處:
中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi),北京。
1.普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC):
中國科學(xué)院微生物研究所,北京(AS):真菌、細(xì)菌。
中國科學(xué)院武漢病毒研究所,武漢(AS—IV): 病毒。
2.農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC):
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所,北京(ISF)。
3.工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC):
中國食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究所,北京(IFFI)。
4. 醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC):
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所,南京(ID): 真菌。
衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所,北京(NICPBP):細(xì)菌。
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所,北京(IV):病毒。
5.抗生素菌種保藏管理中心(CACC):
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗菌素研究所,北京(IA)和四川抗菌素工業(yè)研究所,成都(SIA):新抗菌素菌種。
華北制藥廠抗菌素研究所,石家莊(IANP):生產(chǎn)用抗菌素菌種。
6. 獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC):
農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京(CIVBP)。
(二)國外著名菌種保藏中心
1.美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(ATCC),美國馬里蘭州,羅克維爾市。
2.冷泉港研究室(CSH),美國。
3.國立衛(wèi)生研究院(NIH),美國,馬里蘭州,貝塞斯達(dá)。
4.美國農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部(NRRL),美國,皮奧里亞市。
5.威斯康新大學(xué),細(xì)菌學(xué)系(WB),美國,威斯康新州馬迪孫。
6.國立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(NCTC),英國,倫敦。
7.英聯(lián)邦真菌研究所(CMI),英國,丘(園)。
8.荷蘭真菌中心收藏所(CBS),荷蘭,巴爾恩市。
9.日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所(IAM),日本,東京。
10. 發(fā)酵研究所(IFO),日本,大阪。.
11.日本北海道大學(xué)農(nóng)業(yè)部(AHU), 日本,北海道扎幌市。
12. 科研化學(xué)有限公司(KCC),日本,東京。
13.國立血清研究所(SSI),丹麥。
14.世界衛(wèi)生組織(WHO)。
5.2. 菌種的退化與復(fù)壯
5.2.1. 菌種的退化現(xiàn)象
隨著菌種保藏時(shí)間的延長或菌種的多次轉(zhuǎn)接傳代,菌種本身所具有的優(yōu)良的遺傳性狀可能得到延續(xù),也可能發(fā)生變異。變異有正變(自發(fā)突變)和負(fù)變兩種,其中負(fù)變即菌株生產(chǎn)性狀的劣化或有些遺傳標(biāo)記的丟失均稱為菌種的退化。但是在生產(chǎn)實(shí)踐中,必須將由于培養(yǎng)條件的改變導(dǎo)致菌種形態(tài)和生理上的變異與菌種退化區(qū)別開來。因?yàn)閮?yōu)良菌株的生產(chǎn)性能是和發(fā)酵工藝條件緊密相關(guān)的。如果培養(yǎng)條件發(fā)生變化,如培養(yǎng)基中缺乏某些元素,會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)孢子數(shù)量減少,也會(huì)引起孢子顏色的改變;溫度、pH值的變化也會(huì)使發(fā)酵產(chǎn)量發(fā)生波動(dòng)等。所有這些,只要條件恢復(fù)正常,菌種原有性能就能恢復(fù)正常,因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。常見的菌種退化現(xiàn)象中,最易覺察到的是菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和生理等多方面的改變,如菌落顏色的改變,畸形細(xì)胞的出現(xiàn)等;菌株生長變得緩慢,產(chǎn)孢子越來越少直至產(chǎn)孢子能力喪失,例如放線菌、霉菌在斜面上多次傳代后產(chǎn)生“光禿”現(xiàn)象等,從而造成生產(chǎn)上用孢子接種的困難;還有菌種的代謝活動(dòng),代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力或其對寄主的寄生能力明顯下降,例如黑曲霉糖化能力的下降,抗菌素發(fā)酵單位的減少,枯草桿菌產(chǎn)淀粉酶能力的衰退等。所有這些都對發(fā)酵生產(chǎn)均不利。因此,為了使菌種的優(yōu)良性狀持久延續(xù)下去,必須做好菌種的復(fù)壯工作。即在各菌種的優(yōu)良性狀沒有退化之前,定期進(jìn)行純種分離和性能測定。
5.2.2. 菌種退化的原因
菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。當(dāng)控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變,就會(huì)引起產(chǎn)量下降;當(dāng)控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變,則使菌種產(chǎn)孢子性能下降。一般而言,菌種的退化是一個(gè)從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。開始時(shí),在群體中只有個(gè)別細(xì)胞發(fā)生負(fù)突變,這時(shí)如不及時(shí)發(fā)現(xiàn)并采用有效措施而一味移種傳代,就會(huì)造成群體中負(fù)突變個(gè)體的比例逐漸增高,最后占優(yōu)勢,從而使整個(gè)群體表現(xiàn)出嚴(yán)重的退化現(xiàn)象。因此,突變在數(shù)量上的表現(xiàn)依賴于傳代,即菌株處于一定條件下,群體多次繁殖,可使退化細(xì)胞在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢,于是退化性狀的表現(xiàn)就更加明顯,逐漸成為一株退化了的菌體。同時(shí),對某一菌株的特定基因來講,突變頻率比較低,因此群體中個(gè)體發(fā)生生產(chǎn)性能的突變不是很容易的,但就一個(gè)經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細(xì)胞而言,發(fā)生突變的機(jī)率比處于休眠狀態(tài)的細(xì)胞大得多,因此,細(xì)胞的代謝水平與基因突變關(guān)系密切,應(yīng)設(shè)法控制細(xì)胞保藏的環(huán)境,使細(xì)胞處于休眠狀態(tài),從而減少菌種的退化。
5.2.3. 防止退化的措施
合理的育種 選育菌種時(shí)所處理的細(xì)胞應(yīng)使用單核的,避免使用多核細(xì)胞;
合理選擇誘變劑的種類和劑量或增加突變位點(diǎn),以減少分離回復(fù);在誘變處理后進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及分離純化,以保證保藏菌種純碎。這些可有效的防止菌種的退化。
選用合適的培養(yǎng)基 有人發(fā)現(xiàn)用老苜蓿根汁培養(yǎng)基培養(yǎng)“5406”抗生菌—細(xì)黃鏈霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌產(chǎn)生菌—藤倉赤霉的培養(yǎng)基中,加入糖蜜、天門冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物質(zhì)時(shí),也有防止菌種退化的效果。也有選取營養(yǎng)相對貧乏的培養(yǎng)基做菌種保藏培養(yǎng)基,如培養(yǎng)基中適當(dāng)限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加,因?yàn)樽儺惗喟胧峭ㄟ^菌株的生長繁殖而產(chǎn)生的,當(dāng)培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富時(shí),菌株會(huì)處于旺盛的生長狀態(tài),代謝水平較高,為變異提供了良好的條件,大大提高了菌株的退化幾率。
創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 在生產(chǎn)實(shí)踐中,創(chuàng)造和發(fā)現(xiàn)一個(gè)適合原種生長的條件可以防止菌種退化,如低溫、干燥、缺氧等。在棲土曲霉3.942 的培養(yǎng)中,有人曾用改變培養(yǎng)溫度的措施(從20-30℃提高到33-34℃)來防止它產(chǎn)孢子能力的退化。
控制傳代次數(shù) 由于微生物存在著自發(fā)突變,而突變都是在繁殖過程中發(fā)生而表現(xiàn)出來的。所以應(yīng)盡量避免不必要的移種和傳代,把必要的傳代降低到最低水平,以降低自發(fā)突發(fā)的機(jī)率。菌種傳代次數(shù)越多,產(chǎn)生突變的幾率就越高,因而菌種發(fā)生退化的機(jī)會(huì)就越多。這要求不論在實(shí)驗(yàn)室還是在生產(chǎn)實(shí)踐上,必須嚴(yán)格控制菌種的移種傳代次數(shù),并根據(jù)菌種保藏方法的不同,確立恰當(dāng)?shù)囊品N傳代的時(shí)間間隔。如同時(shí)采用斜面保藏和其它的保藏方式(真空凍干保藏、砂土管、液氮保藏等),以延長菌種保藏時(shí)間。
利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行移種傳代 在有些微生物中,如放線菌和霉菌,由于其菌的細(xì)胞常含有幾個(gè)核或甚至是異核體,因此用菌絲接種就會(huì)出現(xiàn)不純和衰退,而孢子一般是單核的,用它接種時(shí),就沒有這種現(xiàn)象發(fā)生。有人在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)構(gòu)巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化,而改用子囊孢子移種傳代則不易退化;還有人采用滅過菌的棉團(tuán)輕巧地沾取“5406”孢子進(jìn)行斜面移種,由于避免了菌絲的接入,因而達(dá)到了防止退化的效果。
采用有效的菌種保藏方法 用于工業(yè)生產(chǎn)的一些微生物菌種,其主要性狀都屬于數(shù)量性狀,而這類性狀恰是最容易退化的。因此,有必要研究和制定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。
5.2.4. 退化菌種的復(fù)壯
退化菌種的復(fù)壯可通過純種分離和性能測定等方法來實(shí)現(xiàn),其中一種是從退化菌種的群體中找出少數(shù)尚未退化的個(gè)體,以達(dá)到恢復(fù)菌種的原有典型性狀。另一種是在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常而有意識地進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能的測定工作,以達(dá)到菌種的生產(chǎn)性能逐步有所提高。所以這實(shí)際上是一種利用自發(fā)突變不斷從生產(chǎn)中進(jìn)行選種的工作。具體的菌種的復(fù)壯措施如下:
純種分離 采用平板劃線分離法、稀釋平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細(xì)胞分離出來,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)恢復(fù)原菌株的典型優(yōu)良性狀,若能進(jìn)行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細(xì)胞或單孢子分離出來,經(jīng)培養(yǎng)恢復(fù)原菌株性狀。
通過寄主進(jìn)行復(fù)壯 寄生型微生物的退化菌株可接種到相應(yīng)寄主體內(nèi)以提高菌株的活力。
聯(lián)合復(fù)壯 對退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的DTG聯(lián)合處理進(jìn)行復(fù)壯。
在發(fā)酵工業(yè)中,具有良好性狀的生產(chǎn)菌種的獲得十分不容易,如何利用優(yōu)良的微生物菌種保藏技術(shù),使菌種經(jīng)長期保藏后不但存活健在,而且保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型,特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力,即很少發(fā)生突變,這對于菌種極為重要。
微生物菌種保藏技術(shù)很多,但原理基本一致,即采用低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)、添加保護(hù)劑或酸度中和劑等方法,挑選優(yōu)良純種,最好是它們的休眠體,使微生物生長在代謝不活潑,生長受抑制的環(huán)境中。具體常用的方法有:蒸餾水懸浮或斜面?zhèn)鞔2;干?載體保藏或冷凍干燥保藏;超低溫或在液氮中冷凍保藏等方法。
5.1.1. 蒸餾水懸浮法
這是一種最簡單的菌種保藏方法,只要將菌種懸浮于無菌蒸餾水中,將容器封好口,于10℃保藏即可達(dá)到目的。好氣性細(xì)菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面?zhèn)鞔2?nbsp;
斜面?zhèn)鞔2胤椒ㄊ菍⒕N定期在新鮮瓊脂斜面培養(yǎng)基上、液體培養(yǎng)基中或穿刺培養(yǎng),然后在低溫條件下保存。它可用于實(shí)驗(yàn)室中各類微生物的保藏,此法簡單易行,且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變、菌種退化、菌株污染等不良現(xiàn)象。因此要求最好在基本培養(yǎng)基上傳代,目的是能淘汰突變株,同時(shí)轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平。斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于5℃保藏,以防止培養(yǎng)基脫水并降低代謝活性。此方法一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長期保藏,一般保存時(shí)間為3~6個(gè)月。如放線菌于4~6℃保存,每3個(gè)月移接一次;酵母菌于4~6℃保存,每4~6個(gè)月移接一次;霉菌于4~6℃保存,每6個(gè)月移接一次。
5.1.3. 礦物油中浸沒保藏
此方法簡便有效,可用于絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。是將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物或穿刺培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下或冰箱中保藏,操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長,然后注入經(jīng)160℃干熱滅菌1~2h或濕熱滅菌后120℃烘去水分的礦物油,礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜,并以橡皮塞代替棉塞封口,這樣可使菌種保藏時(shí)間延長至1~2年。以液體石蠟作為保藏方法時(shí),應(yīng)對需保藏的菌株預(yù)先作試驗(yàn),因?yàn)槟承┚耆缃湍、霉菌、?xì)菌等能利用石蠟為碳源,還有些菌株對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏,為了預(yù)防不測,一般保藏菌株 2~3年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn)。
5.1.4. 干燥-載體保藏
此法適用于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物的保藏。是將菌種接種于適當(dāng)?shù)妮d體上,如河砂、土壤、硅膠、濾紙及麩皮等,以保藏菌種。以沙土保藏用得較多,制備方法為:將河砂經(jīng)24目過篩后用10%~20%鹽酸浸泡3~4 h,以除去其中所含的有機(jī)物,用水漂洗至中性,烘干,然后裝入高度約1cm的河沙于小試管中,121℃間歇滅菌3次。用無菌吸管將孢子懸液滴入砂粒小管中,經(jīng)真空干燥8 h,于常溫或低溫下保藏均可,保存期為1~10年。土壤法以土壤代替砂粒,不需酸洗,經(jīng)風(fēng)干、粉碎,然后同法過篩、滅菌即可。一般細(xì)菌芽孢常用砂管保藏,霉菌的孢子多用麩皮管保藏。
5.1.5. 冷凍保藏
冷凍保藏是指將菌種于-20℃以下的溫度保藏, 冷凍保藏為微生物菌種保藏非常有效的方法。通過冷凍,使微生物代謝活動(dòng)停止。一般而言,冷凍溫度愈低,效果愈好。為了保藏的結(jié)果更加令人滿意,通常在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑;同時(shí)還要認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速度。冷凍保藏的缺點(diǎn)是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。
普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃):將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上,待生長適度后,將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好,于冰箱的冷藏室中貯藏,或于溫度范圍在-5~20℃的普通冰箱中保存;蛘邔⒁后w培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分別接到試管或指管內(nèi),嚴(yán)格密封后,同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力 1~2年。應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。這一方法雖簡便易行,但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。
超低溫冷凍保藏技術(shù):要求長期保藏的微生物菌種,一般都應(yīng)在-60℃以下的超低溫冷藏柜中進(jìn)行保藏。超低溫冷凍保藏的一般方法是:先離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞,再用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞,然后加入等體積的20%甘油或10%二甲亞砜冷凍保護(hù)劑,混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中,于-70℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1~2℃/ min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。
液氮冷凍保藏技術(shù):近年來,大量有特殊意義和特征的高等動(dòng)、植物細(xì)胞能夠在液氮中長期保藏,并發(fā)現(xiàn)在液氮中保藏的菌種的存活率遠(yuǎn)比其他保藏方法高且回復(fù)突變的發(fā)生率極低。液氮保藏巳成為工業(yè)微生物菌種保藏的最好方法。具體方法是:把細(xì)胞懸浮于一定的分散劑中或是把在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的菌種直接進(jìn)行液體冷凍,然后移至液氮(-196℃)或其蒸汽相中(-l56℃)保藏。進(jìn)行液氮冷凍保藏時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制致冷速度。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟是先制備冷凍保藏菌種的細(xì)胞懸液,分裝0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶,玻璃安瓿用酒精噴燈封口。然后以1.2℃/min的致冷速度降溫,直到溫度達(dá)到相對溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30℃)。待細(xì)胞凍結(jié)后,將致冷速度降為1℃/min,直到溫度達(dá)到-50℃,將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相 (-156℃)中保存。如果無控速冷凍機(jī),則一般可用如下方法代替:將安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷凍4h,然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷凍保藏中,最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油,最終使用濃度一般為甘油10%、二甲亞砜5%。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌,而二甲亞砜最好為過濾滅菌。
5.1.6. 真空凍干保藏
真空冷凍干燥的基本方法是先將菌種培養(yǎng)到最大穩(wěn)定期后,一般培養(yǎng)放線菌和絲狀真菌約需7~10天,培養(yǎng)細(xì)菌約需24~28小時(shí),培養(yǎng)酵母約需3天。然后混懸于含有保護(hù)劑的溶液中,保護(hù)劑常選用脫脂乳、蔗糖、動(dòng)物血清、谷氨酸鈉等,菌液濃度為109~1019個(gè)/ml,取0.1~0.2ml菌懸液置于安瓿管中冷凍,再于減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華至1%~5%,使培養(yǎng)物干燥。最后將管口熔封,保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一,大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏,便于運(yùn)輸。但操作過程復(fù)雜,并要求一定的設(shè)備條件。
5.1.7. 寄主保藏
適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的動(dòng)植物病原菌和病毒。
5.1.8. 基因工程菌的保藏
隨著基因工程的不斷發(fā)展,越來越多的基因工程菌需要得到合理的保藏,由于它們的載體質(zhì)粒等所攜帶的外源DNA片段的遺傳性狀不太穩(wěn)定、且其外源質(zhì)粒復(fù)制子很容易丟失。另外,對于宿主細(xì)胞質(zhì);蛲ǔ樯L非必需,一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí),生長速度會(huì)加快。而由質(zhì)粒編碼的抗生素抗性在富集含此類質(zhì)粒的細(xì)胞群體時(shí)極為有用。當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí),抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí),抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。由此看來基因工程菌最好應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。例如,質(zhì)粒pBR322。它除了能將外源DNA 輸入E.coli細(xì)胞外,還賦予E.coli細(xì)胞Ampr和Tetr。如果在培養(yǎng)基中加入Amp和Tet,則培養(yǎng)時(shí)可選擇出含pBR322質(zhì)粒的細(xì)胞。
5.1.9. 菌種保藏機(jī)構(gòu)
1979年7月,我國成立了中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)(CCCCM),委托中國科學(xué)院負(fù)責(zé)全國菌種保藏管理業(yè)務(wù),并確定了與普通、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學(xué)、抗生素和獸醫(yī)等微生物學(xué)有關(guān)的六個(gè)菌種保藏管理中心。各保藏管理中心從事應(yīng)用微生物各學(xué)科的微生物菌種的收集、保藏、管理、供應(yīng)和交流。以便更好地利用微生物資源為我國的經(jīng)濟(jì)建設(shè)、科學(xué)研究和教育事業(yè)服務(wù)。
(一)中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)組織系統(tǒng):
中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)辦事處:
中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi),北京。
1.普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC):
中國科學(xué)院微生物研究所,北京(AS):真菌、細(xì)菌。
中國科學(xué)院武漢病毒研究所,武漢(AS—IV): 病毒。
2.農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC):
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所,北京(ISF)。
3.工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC):
中國食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究所,北京(IFFI)。
4. 醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC):
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所,南京(ID): 真菌。
衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所,北京(NICPBP):細(xì)菌。
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所,北京(IV):病毒。
5.抗生素菌種保藏管理中心(CACC):
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗菌素研究所,北京(IA)和四川抗菌素工業(yè)研究所,成都(SIA):新抗菌素菌種。
華北制藥廠抗菌素研究所,石家莊(IANP):生產(chǎn)用抗菌素菌種。
6. 獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC):
農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京(CIVBP)。
(二)國外著名菌種保藏中心
1.美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(ATCC),美國馬里蘭州,羅克維爾市。
2.冷泉港研究室(CSH),美國。
3.國立衛(wèi)生研究院(NIH),美國,馬里蘭州,貝塞斯達(dá)。
4.美國農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部(NRRL),美國,皮奧里亞市。
5.威斯康新大學(xué),細(xì)菌學(xué)系(WB),美國,威斯康新州馬迪孫。
6.國立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(NCTC),英國,倫敦。
7.英聯(lián)邦真菌研究所(CMI),英國,丘(園)。
8.荷蘭真菌中心收藏所(CBS),荷蘭,巴爾恩市。
9.日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所(IAM),日本,東京。
10. 發(fā)酵研究所(IFO),日本,大阪。.
11.日本北海道大學(xué)農(nóng)業(yè)部(AHU), 日本,北海道扎幌市。
12. 科研化學(xué)有限公司(KCC),日本,東京。
13.國立血清研究所(SSI),丹麥。
14.世界衛(wèi)生組織(WHO)。
5.2. 菌種的退化與復(fù)壯
5.2.1. 菌種的退化現(xiàn)象
隨著菌種保藏時(shí)間的延長或菌種的多次轉(zhuǎn)接傳代,菌種本身所具有的優(yōu)良的遺傳性狀可能得到延續(xù),也可能發(fā)生變異。變異有正變(自發(fā)突變)和負(fù)變兩種,其中負(fù)變即菌株生產(chǎn)性狀的劣化或有些遺傳標(biāo)記的丟失均稱為菌種的退化。但是在生產(chǎn)實(shí)踐中,必須將由于培養(yǎng)條件的改變導(dǎo)致菌種形態(tài)和生理上的變異與菌種退化區(qū)別開來。因?yàn)閮?yōu)良菌株的生產(chǎn)性能是和發(fā)酵工藝條件緊密相關(guān)的。如果培養(yǎng)條件發(fā)生變化,如培養(yǎng)基中缺乏某些元素,會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)孢子數(shù)量減少,也會(huì)引起孢子顏色的改變;溫度、pH值的變化也會(huì)使發(fā)酵產(chǎn)量發(fā)生波動(dòng)等。所有這些,只要條件恢復(fù)正常,菌種原有性能就能恢復(fù)正常,因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。常見的菌種退化現(xiàn)象中,最易覺察到的是菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和生理等多方面的改變,如菌落顏色的改變,畸形細(xì)胞的出現(xiàn)等;菌株生長變得緩慢,產(chǎn)孢子越來越少直至產(chǎn)孢子能力喪失,例如放線菌、霉菌在斜面上多次傳代后產(chǎn)生“光禿”現(xiàn)象等,從而造成生產(chǎn)上用孢子接種的困難;還有菌種的代謝活動(dòng),代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力或其對寄主的寄生能力明顯下降,例如黑曲霉糖化能力的下降,抗菌素發(fā)酵單位的減少,枯草桿菌產(chǎn)淀粉酶能力的衰退等。所有這些都對發(fā)酵生產(chǎn)均不利。因此,為了使菌種的優(yōu)良性狀持久延續(xù)下去,必須做好菌種的復(fù)壯工作。即在各菌種的優(yōu)良性狀沒有退化之前,定期進(jìn)行純種分離和性能測定。
5.2.2. 菌種退化的原因
菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。當(dāng)控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變,就會(huì)引起產(chǎn)量下降;當(dāng)控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變,則使菌種產(chǎn)孢子性能下降。一般而言,菌種的退化是一個(gè)從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。開始時(shí),在群體中只有個(gè)別細(xì)胞發(fā)生負(fù)突變,這時(shí)如不及時(shí)發(fā)現(xiàn)并采用有效措施而一味移種傳代,就會(huì)造成群體中負(fù)突變個(gè)體的比例逐漸增高,最后占優(yōu)勢,從而使整個(gè)群體表現(xiàn)出嚴(yán)重的退化現(xiàn)象。因此,突變在數(shù)量上的表現(xiàn)依賴于傳代,即菌株處于一定條件下,群體多次繁殖,可使退化細(xì)胞在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢,于是退化性狀的表現(xiàn)就更加明顯,逐漸成為一株退化了的菌體。同時(shí),對某一菌株的特定基因來講,突變頻率比較低,因此群體中個(gè)體發(fā)生生產(chǎn)性能的突變不是很容易的,但就一個(gè)經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細(xì)胞而言,發(fā)生突變的機(jī)率比處于休眠狀態(tài)的細(xì)胞大得多,因此,細(xì)胞的代謝水平與基因突變關(guān)系密切,應(yīng)設(shè)法控制細(xì)胞保藏的環(huán)境,使細(xì)胞處于休眠狀態(tài),從而減少菌種的退化。
5.2.3. 防止退化的措施
合理的育種 選育菌種時(shí)所處理的細(xì)胞應(yīng)使用單核的,避免使用多核細(xì)胞;
合理選擇誘變劑的種類和劑量或增加突變位點(diǎn),以減少分離回復(fù);在誘變處理后進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及分離純化,以保證保藏菌種純碎。這些可有效的防止菌種的退化。
選用合適的培養(yǎng)基 有人發(fā)現(xiàn)用老苜蓿根汁培養(yǎng)基培養(yǎng)“5406”抗生菌—細(xì)黃鏈霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌產(chǎn)生菌—藤倉赤霉的培養(yǎng)基中,加入糖蜜、天門冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物質(zhì)時(shí),也有防止菌種退化的效果。也有選取營養(yǎng)相對貧乏的培養(yǎng)基做菌種保藏培養(yǎng)基,如培養(yǎng)基中適當(dāng)限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加,因?yàn)樽儺惗喟胧峭ㄟ^菌株的生長繁殖而產(chǎn)生的,當(dāng)培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富時(shí),菌株會(huì)處于旺盛的生長狀態(tài),代謝水平較高,為變異提供了良好的條件,大大提高了菌株的退化幾率。
創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 在生產(chǎn)實(shí)踐中,創(chuàng)造和發(fā)現(xiàn)一個(gè)適合原種生長的條件可以防止菌種退化,如低溫、干燥、缺氧等。在棲土曲霉3.942 的培養(yǎng)中,有人曾用改變培養(yǎng)溫度的措施(從20-30℃提高到33-34℃)來防止它產(chǎn)孢子能力的退化。
控制傳代次數(shù) 由于微生物存在著自發(fā)突變,而突變都是在繁殖過程中發(fā)生而表現(xiàn)出來的。所以應(yīng)盡量避免不必要的移種和傳代,把必要的傳代降低到最低水平,以降低自發(fā)突發(fā)的機(jī)率。菌種傳代次數(shù)越多,產(chǎn)生突變的幾率就越高,因而菌種發(fā)生退化的機(jī)會(huì)就越多。這要求不論在實(shí)驗(yàn)室還是在生產(chǎn)實(shí)踐上,必須嚴(yán)格控制菌種的移種傳代次數(shù),并根據(jù)菌種保藏方法的不同,確立恰當(dāng)?shù)囊品N傳代的時(shí)間間隔。如同時(shí)采用斜面保藏和其它的保藏方式(真空凍干保藏、砂土管、液氮保藏等),以延長菌種保藏時(shí)間。
利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行移種傳代 在有些微生物中,如放線菌和霉菌,由于其菌的細(xì)胞常含有幾個(gè)核或甚至是異核體,因此用菌絲接種就會(huì)出現(xiàn)不純和衰退,而孢子一般是單核的,用它接種時(shí),就沒有這種現(xiàn)象發(fā)生。有人在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)構(gòu)巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化,而改用子囊孢子移種傳代則不易退化;還有人采用滅過菌的棉團(tuán)輕巧地沾取“5406”孢子進(jìn)行斜面移種,由于避免了菌絲的接入,因而達(dá)到了防止退化的效果。
采用有效的菌種保藏方法 用于工業(yè)生產(chǎn)的一些微生物菌種,其主要性狀都屬于數(shù)量性狀,而這類性狀恰是最容易退化的。因此,有必要研究和制定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。
5.2.4. 退化菌種的復(fù)壯
退化菌種的復(fù)壯可通過純種分離和性能測定等方法來實(shí)現(xiàn),其中一種是從退化菌種的群體中找出少數(shù)尚未退化的個(gè)體,以達(dá)到恢復(fù)菌種的原有典型性狀。另一種是在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常而有意識地進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能的測定工作,以達(dá)到菌種的生產(chǎn)性能逐步有所提高。所以這實(shí)際上是一種利用自發(fā)突變不斷從生產(chǎn)中進(jìn)行選種的工作。具體的菌種的復(fù)壯措施如下:
純種分離 采用平板劃線分離法、稀釋平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細(xì)胞分離出來,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)恢復(fù)原菌株的典型優(yōu)良性狀,若能進(jìn)行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細(xì)胞或單孢子分離出來,經(jīng)培養(yǎng)恢復(fù)原菌株性狀。
通過寄主進(jìn)行復(fù)壯 寄生型微生物的退化菌株可接種到相應(yīng)寄主體內(nèi)以提高菌株的活力。
聯(lián)合復(fù)壯 對退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的DTG聯(lián)合處理進(jìn)行復(fù)壯。