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酶標記抗體

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

  酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體和酶標記SPA等。酶標記物質(zhì)量的好壞直接關系到免疫酶技術的成功與否,因此被稱為關鍵的試劑。酶標記物中最常用的是酶標記抗體,它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當方法連接而成。酶標記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體,其次要有良好的制備方法。目前,高質(zhì)量的酶(如辣根過氧化物酶,簡稱HRP)國內(nèi)已有商品供應。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上,宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。
  (一) 酶制劑及其底物

  凡無毒性又能呈現(xiàn)有色化學反應的酶,原則上均可作為標記用。但作為標記抗體用的酶應滿足下列要求:(1)來源方便,易于純化;(2)比活性高,性質(zhì)穩(wěn)定;(3)酶活性和量能用簡單方法測定。目前在免疫酶技術中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP),其次還有葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。

  由于辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高,穩(wěn)定,分子量小,純酶容易制備,所以最常用。HRP廣泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP由多個同功酶組成,分子量為40,000,等電點為PH3~9,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異,但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm,一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右(最高可達3.4)。RZ值越小,非酶蛋白就越多。值得注意的是,純度并不表示酶活性,如當酶變性后,RZ值仍可不變。

  HRP的催化反應需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料,通過反應可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應的過程如下:

               HRP

         DH2+H2O2────→D+2H2O

  供氫體的種類很多,形成的產(chǎn)物特點不一。如DAB(3.3-二氨基聯(lián)苯胺)的反應產(chǎn)物為不溶性沉淀物,并有電子密度,故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不夠大,且空白孔不易控制到無色,現(xiàn)已很少應用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點是能產(chǎn)生鮮艷的藍綠色產(chǎn)物且靈敏度較高,但反應中受溫度影響較大,而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定,需要在短時間內(nèi)進行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是:OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色,后者產(chǎn)物為藍綠色,二者的可溶性均好,在避光處顏色穩(wěn)定,空白可近于無色,靈敏度上據(jù)報道后者比前者可高4倍以上。另外,還有一種供氫體稱ABTS[2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反應產(chǎn)物呈藍綠色,且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面,ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。

  由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑,因此酶促反應中使用的H2O2不能過量。應控制在經(jīng)較短時間反應后呈色即達高峰(說明H2O2已消耗殆盡)。這樣即使再延長時間也不會增加反應產(chǎn)物的顏色。

  (二) HRP標記抗體的方法

  酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對于制備HRP結(jié)合物,可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。

  戊二醛二步法

  1. 原理:戊二醛為一種雙功能試劑,通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結(jié)合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。

  2. 標記步驟:

  (1) 稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室溫靜置過夜。

  (2) 反應后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱,用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘,收集棕色流出液。如體積大于5ml,則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中,緩慢攪拌。

  (3) 將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml,攪拌下逐滴加入酶溶液中。

  (4) 用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml,繼續(xù)攪拌3?小時。

  (5) 加0.2M賴氨酸0.25ml,混勻后,置室溫2小時。

  (6) 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨,置4℃1小時。

  (7) 3000rpm離心半小時,棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

  (8) 將上述溶液裝入透析袋中,對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析,去除銨離子后(用萘氏試劑檢測),10,000rpm離心30分鐘去除沉淀,上清液即為酶結(jié)合物,分裝后,冰凍保存。

  3. 結(jié)果判定:

  (1) 定性及效價滴定:用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色,可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式實驗系統(tǒng)里)對酶結(jié)合物進行滴定( 見本節(jié) (三)工作濃度的選擇)。

  (2) 定量和克分子比值測定:可用分光光度計測定(光程1cm)。

  酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4

  IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62

         酶量(mg/ml)   IgG量(mg/ml)   酶量
  克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 4
          40,000       160,000   IgG量

   (3) 本法標記步驟比較簡單,重復性好。缺點是酶的利用率低,一般只有2~4%的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。

  4. 試劑及器材:

  (1) 0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS):取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml,NaCl1.8克,加蒸餾水至200ml。

  (2) 1.25%戊二醛液:取25%戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。

  (3) 1M PH9.5碳酸鹽緩沖液:取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。

  (4) 0.2M賴氨酸溶液:稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。

  (5) 0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。

  (6) PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。

  (7) 萘氏試劑及聚乙二醇(PEG,MW2000)。

  (8) 純化的特異性抗體或抗Ig抗體。

  (9) HRP(RZ>3.0)。

  (10) Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。

  (11) 攪拌器,分光光度計,離心機。

  (12) 透析袋,大、小燒杯,試管,吸管等。

 

  簡易過碘酸鈉法

  本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再與Ig上的氨基相結(jié)合,所獲酶標記抗體的產(chǎn)率高,將近70%的HRP和Ig結(jié)合,99%的Ig與酶結(jié)合,酶與Ig的活性無重大損失,是目前最常用的方法。

  1. 原理:經(jīng)典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連,形成斯夫氏鹼,后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標記抗體。

  2. 標記步驟:

  (1) 稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。

  (2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室溫下避光攪拌20分鐘。

  (3) 將上述溶液裝入透析袋中,對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析,4℃過夜。

  (4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液,使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mg IgG(抗體,或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中,室溫避光輕輕攪拌2小時。

  (5) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混勻,再置4℃2小時。

  (6) 將上述液裝入透析袋中,對0.15M PH7.4 PBS透析,4℃過夜。

  其余步驟(純化)同戊二醛標記步驟的(6)、(7)、(8)。

  3. 結(jié)果判定:

  除標記物IgG量的計算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。

  IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62

  4. 試劑及器材:

  (1) 0.1M NaIO4:稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學試劑廠,批號830602)溶于蒸餾水10ml中。

  (2) 1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液:

  0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml

  0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml

  加蒸餾水至2,000ml。

  (3) 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:

       Na2CO3 0.32克

       NaHCO3 0.586克

       加蒸餾水至50ml

  再用蒸餾水作20倍稀釋,即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。

  (4) NaBH4溶液(4mg/ml):

  臨用時稱取NaBH44mg溶于1ml蒸餾水中。

  (5) 其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。

  (三) 工作濃度的選擇

  在免疫酶技術中,首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化,便可導致試驗結(jié)果產(chǎn)生很大的波動。另外,由于濃度過高,可使非特異性反應增加,而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此,正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。

  酶標記抗體的滴定方法是:將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上,然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應,以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價,或稱工作濃度。

  其步驟為:先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右,于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml,4℃過夜,次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600……(根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定),分別加入反應孔中,每個稀釋度二孔,每孔0.1ml,37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液,每孔0.1ml,37℃10~30分鐘。以2M H2SO4 0.05ml終止反應。

  結(jié)果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以OD為縱座標,結(jié)合物濃度為橫座標,繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右,且曲線斜率最大時的酶標抗體稀釋度,即為該標記物的工作濃度。

  有關試驗的試劑及器材均見ELISA部分。

  要說明的是,本法為ELISA直接法,所測的工作濃度與在實際應用中的最適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA實驗系統(tǒng)中,因此基礎上還應進一步確定實際工作濃度(可采用方陣法),以達到最適的實驗條件。

  (四) 注意事項

  1. 在具備高質(zhì)量HRP的條件下,所要標記的抗體也要活性高,效價高(最低1∶16),純度高,親和力好,這是保證標記物效價高,免疫活性好的首要條件。

  2. 所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑,最好(或必需)新鮮配制。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應為新鮮純品,因戊二醛儲存過久可形成縮和體(雜質(zhì))。否則,影響標記效果。

  3. 室溫攪拌時須避光,室內(nèi)溫度一般在25℃為宜。標記物每次透析前,須認真檢查,防止漏液。

  4. 濃的標記物相當穩(wěn)定,常加入30~40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1~2年,但稀釋成1∶10,只能保存數(shù)周。已配制的使用液應在12小時內(nèi)用完。切忌反復凍融。

 
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