免疫電泳技術

（一）原理
免疫電泳是瓊脂平板電泳和雙相免疫擴散兩種方法的結合。將抗原樣品在瓊脂平板上先進行電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開，然后加入抗體做雙相免疫擴散，把已分離的各抗原成分與抗體在瓊脂中擴散而相遇，在二者比例適當?shù)牡胤剑�形成肉眼可見的沉淀弧�?br />該方法可以用來研究：①抗原和抗體的相對應性；②測定樣品的各成分以及它們的電泳遷移率；③根據(jù)蛋白質的電泳遷移率，免疫特性及其它特性，可以確定該復合物中含有某種蛋白質；④鑒定抗原或抗體的純度。
（二）試劑與器材
同瓊脂平板電泳。
（三）操作方法
1．在玻璃板的中央放置一小玻棒（d=2mm~3mm），然后用0.05mol/L pH8.6巴比妥緩
沖液配制1％瓊脂，制成瓊脂板，板厚2mm.。
2．在玻棒的兩側，板中央或1／3處，距玻棒4mm～8mm各打直徑3mm～6mm的孔。
3．在孔內加滿血清。
4．將玻璃板置電泳槽上進行電泳。電流為2mA/cm～3mA/cm（或電壓3V/cm～6V/cm），
電泳時間4h～6h。
5．停止電泳，用小刀片在玻璃板兩側切開，取出玻璃棒，加抗血清樣品。
6．于濕盒內37℃（或常溫）擴散24h，取出觀察。
7．于生理鹽水中浸泡24h，中間換液數(shù)次，取出后，加0.05％氨基黑染色5min～10min，然后以1mol/L冰醋酸脫色至背景無色為止。
8．制膜、觀察、保存標本。
（四）免疫電泳結果分析
1．常見的沉淀弧 由于經(jīng)電泳已分離的各抗原成分在瓊脂中呈放射狀擴散，而相應的抗體呈直線擴散，因此生成的沉淀一般多呈弧形，常見的弧形如下：①交叉�。罕硎緝蓚�抗原成分的遷移率相近，但抗原性不同；②平行弧：表示兩個不同的抗原成分，它們的遷移率相同，但擴散率不同；③加寬�。阂话闶怯捎诳乖�過量所致；④分枝�。阂话闶怯捎诳贵w過量；⑤沉淀線中間逐漸加寬并接近抗體槽，一般由于抗原過量，在白蛋白位置處形成；⑥其它還有彎曲弧、平坦弧、半弧等。
2．沉淀弧的曲度 勻質性的物質具有明確的遷移率，能生成曲度較大的沉淀弧。反之有較寬遷移范圍的物質，其沉淀弧曲度較小。
3．沉淀的清晰度 沉淀線的清晰度與抗原抗體的特異性程度有關，也與抗體的來源有關。抗血清多來源于兔、羊、馬。兔抗體的特點是形成沉淀線寬而淡，抗體過量對沉淀線影響較小，而抗原過量，沉淀線發(fā)生部分溶解。馬抗血清所形成的沉淀線致密、清晰，抗原或抗體過量時，復合物沉淀溶解、消失，而且產(chǎn)生繼發(fā)性的非特異性沉淀。因此使用抗原抗體時，一定要找好適當?shù)谋壤��?br />4．沉淀弧的位置 高分子量的物質擴散慢，所形成的沉淀線離抗原孔較近；而分子量較小的物質，擴散速度快，沉淀弧離抗體槽近一些。抗原濃度高沉淀弧偏近抗體槽，反之，抗體濃度過高，沉淀弧偏近抗原孔。
（五）注意事項
1．免疫電泳分析法的成功與否，主要取決于抗血清的質量�？寡�清中必須含有足夠的抗體，才能同被檢樣品中所有抗原物質生成沉淀反應。
2．抗血清雖然含有對所有抗原物質的相應抗體，但抗體效價有高有低，因此要適當考慮抗原孔徑的大小和抗體槽的距離。
3．免疫電泳要求分析的物質一方為抗原，另一方為沉淀反應性抗體。因此沒有抗原性的物質或抗原性差的物質、非沉淀反應性抗體，均不能用免疫電泳進行分析。