FCM以它的快速、靈活及定量的特點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的各個(gè)方面，尤其是結(jié)合單克隆抗體技術(shù)，在免疫分型、分選、腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)測、機(jī)體免疫狀態(tài)的監(jiān)測、免疫細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面更能起到重要作用，成為現(xiàn)代免疫技術(shù)的重要組成部分�；诿庖呒夹g(shù)是免疫細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)的基礎(chǔ)，我們著重介紹FCM在免疫應(yīng)用中的技術(shù)問題。
�。�1）免疫應(yīng)用的激發(fā)光源和濾片系統(tǒng)：適用于免疫技術(shù)的FCM的激發(fā)光是氪離子氣體激光器，光譜中波長為531nm和856nm的譜線最強(qiáng)。為了擴(kuò)大儀器對雙標(biāo)記或三標(biāo)記染色的熒光信號的分辨范圍可使用雙激光光源。
為了減少細(xì)胞由于激光束造成的散射光對光電倍增管的影響，要使用貼有干涉膜的濾片系統(tǒng)。為了同時(shí)測定兩種波長以上的熒光信號，光路中還要使用二向性分光元件。
為了測定伴隨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程所產(chǎn)生的早期免疫及生化性質(zhì)的改變，例如膜的流行性，DNA構(gòu)象變化等，可以使用偏振片。
總之，應(yīng)用于免疫學(xué)時(shí)要充分考慮有關(guān)光源及光學(xué)濾片系統(tǒng)的正確使用。
�。�2）免疫應(yīng)用的熒光染料及染色：免疫應(yīng)用中的熒光染料主要有FITC（488nm）、TRITC（515nm）、PE（藻紅蛋白，575nm）及其組合。在進(jìn)行多種標(biāo)記時(shí)特別要注意結(jié)合抗體的每種色素都不干擾抗體反應(yīng)的特異性，也不相互干擾。
免疫熒光染色有直接法和間接法二類：
�、僦苯尤旧�
1）取約106的細(xì)胞置于尖底離心管內(nèi)，管內(nèi)液體要少些。加熒光標(biāo)記抗體，在4℃溫度下靜置15～30min。若作雙標(biāo)記染色也可直接加入。
2）用冷的10%的小牛血清、0.1%的疊氮鈉溶液，1/15mol/L的PBS（pH4.4）離心清洗細(xì)胞2次。1000rpm離心5min或4000rpm離心1min。
3）加入適量緩沖液待測。
�、陂g接染色法：
1）取106細(xì)胞加特異的第一抗體，4℃溫度下靜置15～30min。
2）加緩沖液離心清洗2次后，吸盡殘留液體，彈散沉淀，加入熒光標(biāo)記的第二抗體，4℃靜置30 min。
3）緩沖液離心清洗2次后加入適量緩沖液待測。為減少無關(guān)因素干擾，操作盡量在水浴中進(jìn)行。
染色中應(yīng)注意的事項(xiàng)：①細(xì)胞標(biāo)本在整個(gè)過程中要盡量保持新鮮，采用有效措施防止表面抗原消失和細(xì)胞死亡；②熒光標(biāo)記物用前應(yīng)用濾膜或高速離心去除顆粒或沉渣以減少非特異性干擾；③細(xì)胞標(biāo)本染色前應(yīng)除死細(xì)胞；④為提高靈敏度可用三步間接染色法。
�。�3）免疫熒光標(biāo)本的特殊處理：
�、偎兰�(xì)胞及碎片去除：樣品中不可避免地存在著死細(xì)胞及碎片，影響分析結(jié)果。對于血細(xì)胞可用FCM通過0。散射的差異不經(jīng)染色而將死細(xì)胞分出棄除；對于培養(yǎng)細(xì)胞，由于其大小分布不均，可在樣品內(nèi)加少量PI染色后將死細(xì)胞去掉。一般情況下即可用儀器直接去除碎片，也可用血清沉降法去除大碎片，用離法去除小碎片。
�、跇�(biāo)本的保存和固定：實(shí)驗(yàn)中大多數(shù)樣品在染色或分析前需要保存一定的時(shí)間，有時(shí)甚至需要進(jìn)行固定。
未染色的新鮮標(biāo)本貯存方法如下：10%二甲基亞砜，90%小牛血清，5×106～1×107細(xì)胞在-70℃過夜，然后置液氮中可長期保存。
免疫染色未經(jīng)固定的標(biāo)本在4℃可保存48h。若需存放時(shí)間較長、或標(biāo)本具有傳染性，應(yīng)該用固定劑固定。常用的固定劑配方是：1%～4%的多聚甲醛和PBS或0.8%的生理鹽水配成p H7.2的固定液；或用0.37%～1.5%甲醛和PBS配成p H7.4的固定液。固定方法是：將經(jīng)免疫熒光染色的細(xì)胞離心沉淀，再加入固定液混勻，放在4℃溫度保存。一般來說，經(jīng)固定處理的標(biāo)本保存1周至2個(gè)月，多數(shù)樣品的陽性細(xì)胞群體比例及熒光強(qiáng)度增色能保持在正常范圍之內(nèi)。
�。�4）主要檢測的免疫指標(biāo)：
�、偌�(xì)胞毒試驗(yàn)：細(xì)胞毒是機(jī)體的一種免疫監(jiān)督機(jī)制，細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)重要的免疫指標(biāo)。例如天然殺傷細(xì)胞NK（Natural killer）是一種引起免疫媒介的效應(yīng)物，在抗腫瘤及感染因子的免疫監(jiān)督系統(tǒng)中起著重要作用。研究表明，對NK細(xì)胞的測量可以做為免疫治療監(jiān)測的重要參數(shù)和有效的預(yù)后征狀的指標(biāo)。所使用的熒光探針為CFDA（Caboxy-fluorescein diacetate）。
②吞噬功能實(shí)驗(yàn)：單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)是機(jī)體的主要防御系統(tǒng)之一。FCM可以快速、定量地檢查吞噬細(xì)胞的吞噬能力和速度。
�、跧型變變態(tài)反應(yīng)的IgE受體細(xì)胞、IgE結(jié)合因子的檢查。
④胞漿Ig及血清Ig分析，血小板表面的IgG測定，等等。