(一)材料及試劑
1.器材
⑴細(xì)胞培養(yǎng)板:滅菌的國(guó)產(chǎn)96孔或40孔平底聚苯乙烯塑料板或進(jìn)口96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
⑵50μl、100μl、300μl微量加樣器,滅菌的塑料滴頭。
⑶無(wú)菌透明膠帶,其密度與塑料板一致。
⑷滅菌的離心管
⑸倒置顯微鏡
2.IBR Baitha—Nu/67弱毒株凍干毒,標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清,標(biāo)準(zhǔn)陰性血清,均由指定單位供應(yīng)。
3.細(xì)胞培養(yǎng)液
Eagles MEM 45%
0.5%水解乳蛋白-Earle液 45%
犢牛血清 10%
谷氨酰胺 0.03%
青、鏈霉素各200μg/ml
用7%NaHCO3液調(diào)pH6.8~7.0。
(二)操作方法
1.細(xì)胞制備 滅菌采取犢牛腎或睪丸,按常規(guī)胰蛋白酶消化法制備牛腎(BK)或睪丸(BT)細(xì)胞,置37℃溫箱培養(yǎng),長(zhǎng)成良好單層細(xì)胞備用。一般使用次代細(xì)胞,但不超過(guò)4代。
2.病毒抗原制備 將IBR Baitha—Nu/67弱毒株凍干毒用LE(0.5%水解乳蛋白—Earle液)作10倍稀釋?zhuān)¢L(zhǎng)成良好的單層細(xì)胞(BK或BT),用Earle’s液洗一次后,按原培養(yǎng)液1/10的量接毒。置37℃溫箱吸附1h,然后加入pH7.1~7.2含青、鏈霉素200g/μgml的LE液至原培養(yǎng)液量,37℃培養(yǎng),待80%~90%出現(xiàn)典型IBR病變時(shí)收獲培養(yǎng)物,凍融2次后,3 000r/min離心10min,其上清即為病毒抗原。測(cè)定病毒滴度(TCID)并分裝小瓶,貯于-70℃?zhèn)溆。半年?nèi)滴度保持不變。
3.病毒滴度測(cè)定 將制備的病毒抗原,用pH7.0~7.2的LE液作10倍遞增稀釋至10-7,每病毒稀釋滴度液接種細(xì)胞培養(yǎng)板4孔,每孔50μl,隨后每孔加入細(xì)胞懸液(50~60萬(wàn)細(xì)胞/ml)10μl和細(xì)胞培養(yǎng)液50μl。設(shè)4孔細(xì)胞對(duì)照。用透明膠帶封板,置37℃培養(yǎng)。觀察1周,每天記錄細(xì)胞病變情況。
細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50)的確定按Reed-Muench方法計(jì)算,即:
TCID50=高于50%死亡率的病毒稀釋度的對(duì)數(shù) 距離比值×稀釋倍數(shù)(10)的對(duì)數(shù)。
4.無(wú)菌采集被檢血清,不加任何防腐劑。各種血清均56℃滅能30min。
5.將一瓶已知滴度IBR病毒抗原,用pH7.0~7.2的LE液稀釋成100TCID50/0.05ml,取0.3ml與等量的被檢血清于小試管中,37℃溫箱中和1h。
6.將已中和的被檢血清—病毒混合液加入培養(yǎng)板孔中,每個(gè)樣品接種4孔,每孔100ul。再于每一樣品孔中加入100μl細(xì)胞懸液,用透明膠帶封板,37℃培養(yǎng)。
7.每次試驗(yàn)時(shí),均設(shè)立以下對(duì)照:
(1) 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清 抗原,標(biāo)準(zhǔn)陰性血清 抗原,其操作程序同試驗(yàn)組。
(2) 被檢血清毒性對(duì)照:每份被檢血清樣品接種2孔,每孔50μl,補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液50ml,再加細(xì)胞懸液100μl。
(3) 細(xì)胞對(duì)照:每孔加100μl細(xì)胞懸液,補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液100μl。
(4) 實(shí)際使用病毒抗原工作量的測(cè)定:將病毒抗原工作溶液(100TCID50/0.05μl)作10倍遞增稀釋至10-3,每個(gè)稀釋度接種4孔,每孔50μl,補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液50μl,再加細(xì)胞懸液100μl。計(jì)算本次試驗(yàn)每0.05ml中TCID50的實(shí)際含量。
(三)結(jié)果判定
1.接種后72h判定結(jié)果 當(dāng)病毒抗原工作液對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對(duì)照均出現(xiàn)典型細(xì)胞病變。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照無(wú)細(xì)胞病變,被檢血清對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性,細(xì)胞對(duì)照正常病毒抗原實(shí)際含量在30~300TCID50時(shí),方能判定,否則被認(rèn)為無(wú)效。
2.判定標(biāo)準(zhǔn) 未經(jīng)稀釋的被檢血清能使50%或50%以上細(xì)胞孔不出現(xiàn)病變者判為陽(yáng)性。