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免疫電泳

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

原理

免疫電泳是瓊脂平板電泳和雙相免疫擴散兩種方法的結(jié)合。將抗原樣品在瓊脂平板上先進(jìn)行電泳,使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開,然后加入抗體做雙相免疫擴散,把已分離的各抗原成分與抗體在瓊脂中擴散而相遇,在二者比例適當(dāng)?shù)牡胤,形成肉眼可見的沉淀弧?/p>

該方法可以用來研究:①抗原和抗體的相對應(yīng)性;②測定樣品的各成分以及它們的電泳遷移率;③根據(jù)蛋白質(zhì)的電泳遷移率,免疫特性及其它特性,可以確定該復(fù)合物中含有某種蛋白質(zhì);④鑒定抗原或抗體的純度。


試劑與器材

同瓊脂平板電泳。


操作方法

1.在玻璃板的中央放置一小玻棒(d=2mm~3mm),然后用0.05mol/L pH8.6巴比妥緩

沖液配制1%瓊脂,制成瓊脂板,板厚2mm.。

2.在玻棒的兩側(cè),板中央或1/3處,距玻棒4mm~8mm各打直徑3mm~6mm的孔。

3.在孔內(nèi)加滿血清。

4.將玻璃板置電泳槽上進(jìn)行電泳。電流為2mA/cm~3mA/cm(或電壓3V/cm~6V/cm),

電泳時間4h~6h。

5.停止電泳,用小刀片在玻璃板兩側(cè)切開,取出玻璃棒,加抗血清樣品。

6.于濕盒內(nèi)37℃(或常溫)擴散24h,取出觀察。

7.于生理鹽水中浸泡24h,中間換液數(shù)次,取出后,加0.05%氨基黑染色5min~10min,然后以1mol/L冰醋酸脫色至背景無色為止。

8.制膜、觀察、保存標(biāo)本。


免疫電泳結(jié)果分析

1.常見的沉淀弧 由于經(jīng)電泳已分離的各抗原成分在瓊脂中呈放射狀擴散,而相應(yīng)的抗體呈直線擴散,因此生成的沉淀一般多呈弧形,常見的弧形如下:①交叉。罕硎緝蓚抗原成分的遷移率相近,但抗原性不同;②平行。罕硎緝蓚不同的抗原成分,它們的遷移率相同,但擴散率不同;③加寬。阂话闶怯捎诳乖^量所致;④分枝。阂话闶怯捎诳贵w過量;⑤沉淀線中間逐漸加寬并接近抗體槽,一般由于抗原過量,在白蛋白位置處形成;⑥其它還有彎曲弧、平坦弧、半弧等。

2.沉淀弧的曲度 勻質(zhì)性的物質(zhì)具有明確的遷移率,能生成曲度較大的沉淀弧。反之有較寬遷移范圍的物質(zhì),其沉淀弧曲度較小。

3.沉淀的清晰度 沉淀線的清晰度與抗原抗體的特異性程度有關(guān),也與抗體的來源有關(guān)?寡宥鄟碓从谕、羊、馬。兔抗體的特點是形成沉淀線寬而淡,抗體過量對沉淀線影響較小,而抗原過量,沉淀線發(fā)生部分溶解。馬抗血清所形成的沉淀線致密、清晰,抗原或抗體過量時,復(fù)合物沉淀溶解、消失,而且產(chǎn)生繼發(fā)性的非特異性沉淀。因此使用抗原抗體時,一定要找好適當(dāng)?shù)谋壤?/p>

4.沉淀弧的位置 高分子量的物質(zhì)擴散慢,所形成的沉淀線離抗原孔較近;而分子量較小的物質(zhì),擴散速度快,沉淀弧離抗體槽近一些?乖瓭舛雀叱恋砘∑贵w槽,反之,抗體濃度過高,沉淀弧偏近抗原孔。


注意事項

1.免疫電泳分析法的成功與否,主要取決于抗血清的質(zhì)量?寡逯斜仨毢凶銐虻目贵w,才能同被檢樣品中所有抗原物質(zhì)生成沉淀反應(yīng)。

2.抗血清雖然含有對所有抗原物質(zhì)的相應(yīng)抗體,但抗體效價有高有低,因此要適當(dāng)考慮抗原孔徑的大小和抗體槽的距離。

3.免疫電泳要求分析的物質(zhì)一方為抗原,另一方為沉淀反應(yīng)性抗體。因此沒有抗原性的物質(zhì)或抗原性差的物質(zhì)、非沉淀反應(yīng)性抗體,均不能用免疫電泳進(jìn)行分析。

 
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