酶標(biāo)抗體的鑒定

1．酶標(biāo)抗體的活性鑒定 一般以瓊脂擴(kuò)散和免疫電泳進(jìn)行鑒定。使酶標(biāo)抗體和相應(yīng)的抗原(抗原濃度為1mg/ml)產(chǎn)生沉淀線,洗滌后于底物溶液中顯色,顯色后用生理鹽水漂洗,沉淀線不褪色,說(shuō)明酶和抗體都具有活性。良好的酶標(biāo)結(jié)合物瓊脂擴(kuò)散滴度一般應(yīng)在1：16以上。

2．酶結(jié)合物的定量測(cè)定 包括酶量、IgG含量、酶與IgG克分子比值以及結(jié)合率的測(cè)定。

酶量(µg/ml)=OD_403nm×0.42

（1）戊二醛法：IgG(mg/ml)=(OD_280nm－OD_403nm×0.42)×0.94×0.62

(OD₄₀₃×0.42為酶在403nm的光密度，抗體與酶－戊二醛結(jié)合后OD_280nm約增加6%，所以乘以0.94校正。由于兔IgGOD_280nm=1.0時(shí)為0.62mg，所以又乘以0.62)。

（2）過(guò)碘酸鈉法：IgG(mg/ml)=(OD₂₈₀－OD₄₀₃×0.30)×0.62

(3)克分子比值=(酶ug/m) /40000/[(IgG mg/ml) / 160 000]=酶X4 /IgG

(40 000和160 000分別為辣根過(guò)氧化物酶和IgG的分子量)。

⑷ 酶結(jié)合率=結(jié)合物中的酶量/標(biāo)記時(shí)加入的酶量×100%。

⑸ 酶標(biāo)記率：OD_403nm/OD_280nm即酶中正鐵血紅素輔基的吸光度(403nm)與抗體－酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRP在Ab^E中所占的比例，它與E/Ab克分子比值呈高度正相關(guān)。

3．酶結(jié)合物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 純化的酶結(jié)合物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括以下幾個(gè)方面。

（1）酶的催化活性。

（2）免疫學(xué)活性。

（3）未聯(lián)接的游離酶的量。

（4）未聯(lián)接的原始免疫反應(yīng)物的量。

（5）每個(gè)酶分子所聯(lián)接的免疫反應(yīng)物分子數(shù)目。

（6）生化性質(zhì)。

（7）酶標(biāo)記免疫試驗(yàn)效果。

酶結(jié)合物的質(zhì)量差異,可引起試驗(yàn)敏感度的很大變化。例如用不同的程序制得的HRP－IgG結(jié)合物進(jìn)行酶標(biāo)記免疫試驗(yàn)，可得到不同的試驗(yàn)結(jié)果，故應(yīng)予重視。

用于ELISA酶標(biāo)抗體的各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)