ELISA實(shí)驗(yàn)原理及類型
將已知抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離物成分，然后加入底物顯色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。
ELISA可用于檢測(cè)抗體，也可用于檢測(cè)抗原。根據(jù)檢測(cè)目的和操作步驟的不同，通常有三種類型的檢測(cè)方法。
1．間接法 此法是檢測(cè)抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體上，加入待測(cè)血清(抗體)與之結(jié)合，洗滌后，加酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測(cè)定。
2．雙抗體夾心法 此法常用于檢測(cè)抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加入待測(cè)標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體及底物溶液進(jìn)行測(cè)定。
3．競(jìng)爭(zhēng)法 此法可用于抗原及半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體上，加入待測(cè)抗原和一定量的已知酶標(biāo)抗原，使二者競(jìng)爭(zhēng)地與固相抗體結(jié)合，經(jīng)過(guò)洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。
ELISA試驗(yàn)條件的選擇
1．固相載體的選擇 載體的種類很多，其中包括纖維素、交聯(lián)右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。從使用形式上可有凹孔平板、試管、珠粒等。
聚苯乙烯凹孔板是應(yīng)用最廣泛的一種載體。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作簡(jiǎn)便、用量小，適于大批檢查。
由于聚苯乙烯的工藝過(guò)程不夠穩(wěn)定,造成各批次差異較大。所以進(jìn)行ELISA之前，必須進(jìn)行篩選。檢查方法：
⑴ 吸附性能的檢查：先加抗體包被，然后加入同一稀釋度的酶標(biāo)抗體，最后加底物、顯色、測(cè)OD值,求出總平均OD值,再求出每相鄰兩孔的OD平均值,此均值在總均值的±10%以內(nèi)為合格,若中間孔與四周孔OD值相差太大，或一側(cè)與另一側(cè)孔OD值相差較大均屬不合格。
⑵ 對(duì)比測(cè)定陽(yáng)性血清與陰性血清，觀察是否存在明顯差異，若二者OD值相差于10倍以上者為合格。
板的處理。新板一般不用處理,用蒸餾水沖洗即可應(yīng)用。板用一次即廢。但不少實(shí)驗(yàn)工作者認(rèn)為用超聲波處理，清潔液Tritonx100、20%乙二醇處理仍可應(yīng)用。但發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照顯色較深和陽(yáng)性樣品顯色結(jié)果不理想時(shí)，應(yīng)棄去不用。
2．載體的吸附條件 載體的吸附均為物理吸附。吸附的多少取決于PH值、溫度、蛋白濃度、離子強(qiáng)度以及吸附時(shí)間等。
較好的吸附條件是：離子強(qiáng)度為0.05Mol/L～0.10Mol/L，pH9.0～pH9.6碳酸鹽緩沖液，蛋白濃度為1µg/ml~100µg/ml，4℃過(guò)夜或37℃3h。
3．酶標(biāo)抗體使用濃度的確定 于聚苯乙烯板孔中加足夠量的抗體包被,溫育一定時(shí)間，沖洗、把酶標(biāo)結(jié)合物倍比稀釋，每個(gè)稀釋度加2孔,溫育、沖洗、再加底物顯色、比色。以O(shè)D值為縱坐標(biāo),酶標(biāo)結(jié)合物的稀釋度為橫坐標(biāo)，制作曲線。找出OD值為1時(shí)，相對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)抗體稀釋度為最適酶標(biāo)抗體稀釋度。
這個(gè)稀釋度是指在這種條件下的最適稀釋度，換個(gè)條件就不是最適的了。如1﹕400的酶標(biāo)抗體稀釋度溫育6h可與1︰6 400稀釋度溫育24h結(jié)果相同。所以一旦條件確定之后，就不要變更，以保證結(jié)果的重復(fù)性和相對(duì)的準(zhǔn)確性。
此最適酶標(biāo)抗體稀釋度可做為工作濃度，也可提高半個(gè)至一個(gè)滴度，但不能提高過(guò)高，否則非特異性顯色增加。
酶標(biāo)抗體的滴度反映酶標(biāo)抗體的質(zhì)量，也可以此比較酶標(biāo)結(jié)合物的優(yōu)劣。有材料報(bào)道認(rèn)為1︰320滴度為合格,1︰1 000以上更好。酶標(biāo)抗體滴度越高，用于工作濃度的稀釋倍數(shù)就越大，敏感性就越高，非特異性反應(yīng)就越低。
4．抗原：
⑴ 抗原的要求：
用于ELISA的抗原必須采用相當(dāng)純的抗原，如果含有其它雜質(zhì)，將與抗原共同競(jìng)爭(zhēng)固相載體上的有限位置。用于其它血清學(xué)反應(yīng)的抗原不一定能適用ELISA實(shí)驗(yàn)，必須經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，抗原必須能牢固地吸附于載體上，而不喪失其免疫活性，且可得到有規(guī)律的重復(fù)的結(jié)果。另外在吸附載體后，對(duì)加入的各種試劑產(chǎn)生最小的非特異性吸附，即與陰、陽(yáng)性血清結(jié)合差異較大。
⑵ 抗原效價(jià)的測(cè)定 可采用單方陣或雙方陣試驗(yàn)。①單方陣試驗(yàn)：以不同稀釋度的抗原包被酶標(biāo)板，以常規(guī)的1﹕200倍稀釋的陽(yáng)性血清加入，再加入酶標(biāo)抗體、顯色、測(cè)OD值，以O(shè)D值為1.0時(shí)，相應(yīng)的抗原濃度作為使用效價(jià)；②雙方陣試驗(yàn)比較精確，它既能測(cè)出抗原的最適濃度又能測(cè)出抗體的最適濃度。即將抗原抗體均稀釋成不同濃度進(jìn)行酶標(biāo)抗體反應(yīng)，以血清稀釋倍數(shù)最高的陰、陽(yáng)性血清的光吸收值差最大的所對(duì)應(yīng)的抗原稀釋度為抗原的使用效價(jià)。
已吸附的抗原的固相載體經(jīng)凍干或干燥保存很穩(wěn)定,數(shù)月仍不失活。
5．抗體 抗體效價(jià)的測(cè)定同抗原,采用雙方陣試驗(yàn)。
6．清洗液 一般采用0.01Mol/L pH 7.2 PBS吐溫緩沖液。吐溫是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì),常做助溶劑。吐溫的編號(hào)依聚合山梨醇所結(jié)合的脂肪酸種類不同而定。吐溫20是結(jié)合月桂酸、吐溫40是結(jié)合棕櫚酸、吐溫60是結(jié)合硬脂酸,吐溫80是結(jié)合油酸等。通常用吐溫20加入緩沖液內(nèi)做為濕潤(rùn)劑,以減少非特異性吸附。也可在PBS緩沖液中加入1%牛血清白蛋白(或10%小牛血清或卵清蛋白),特別在抗原包被以后,以牛血清白蛋白緩沖液再包被一次,而占據(jù)孔內(nèi)剩下位置,這樣來(lái)減少非特異性反應(yīng)。
7．反應(yīng)時(shí)間 抗原與抗體、抗體與酶標(biāo)抗體反應(yīng)一般在37℃ 2h～3h達(dá)到高峰。時(shí)間太短,敏感性下降,時(shí)間太長(zhǎng),吸附的抗原或復(fù)合物(在這個(gè)溫度下)可能脫落。
酶底物反應(yīng)時(shí)間的確定：一般采用15min～30min～45min。也可以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為準(zhǔn),隨時(shí)測(cè)定其OD值,當(dāng)達(dá)到規(guī)定的OD值時(shí),即終止反應(yīng)。
ELISA結(jié)果判定及表示法
結(jié)果判定，分目測(cè)法和比色法。結(jié)果表示有以下幾種：
1．以“十” “一”表示陽(yáng)性、陰性。
2．直接用OD值表示。
3．用終點(diǎn)滴度表示 即將標(biāo)本連續(xù)稀釋,以最高稀釋度的陽(yáng)性反應(yīng)(如規(guī)定大于某一OD值或陰陽(yáng)性比值大于某一數(shù)值)為該標(biāo)本滴度。
4．以單位表示 將已知陽(yáng)性血清做不同稀釋進(jìn)行滴定,以陽(yáng)性血清的單位數(shù)為橫坐標(biāo),以相對(duì)應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品可根據(jù)其OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出單位數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即可獲得未知樣品的單位數(shù)。