一、概要
克倫特羅(Clenbuterol)屬于β-興奮劑,因?yàn)樵撍幙梢蕴岣呤萑饴,減少脂肪沉積和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng),被一些畜牧養(yǎng)殖企業(yè)作為養(yǎng)殖促進(jìn)劑非法使用。人食用了飼喂克倫特羅作為添加劑的動(dòng)物所產(chǎn)生的畜產(chǎn)品后,殘留的克倫特羅可導(dǎo)致人體肌肉震顫、心悸、神經(jīng)過(guò)敏、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、發(fā)燒、戰(zhàn)栗等癥狀,對(duì)消費(fèi)者的健康造成極大危害。因此世界許多國(guó)家現(xiàn)已被明令禁止在飼料中添加克倫特羅來(lái)增加動(dòng)物的瘦肉率。HPLC或GC-MS一直用作檢測(cè)β興奮劑的方法,但是其前處理步驟費(fèi)用昂貴;而使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒方法則可以經(jīng)濟(jì)、快速地檢測(cè)尿,血清,肌肉,肝臟及飼料中的CLE。
鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)而成的檢測(cè)產(chǎn)品,操作時(shí)間短于45min,能最大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。
二、試驗(yàn)原理
鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被克倫特羅抗原,樣本殘留的克倫特羅和微孔條上預(yù)包被的抗原競(jìng)爭(zhēng)抗克倫特羅抗體,加入酶標(biāo)二抗后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其殘留物克倫特羅負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出樣品中克倫特羅的含量。
三、適用范圍
鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑盒可定性、定量檢測(cè)動(dòng)物組織、飼料、尿液、血清等樣本中克倫特羅的殘留量。
四、交叉反應(yīng)率
克倫特羅 ………………………………………………100%
特普他林 ……………………………………………小于1%
非諾特羅 ……………………………………………小于1%
馬布特羅 ……………………………………………小于1%
西馬特羅 …………………………………………小于1%
溴布特羅 ……………………………………………小于1%
塞曼特羅 ……………………………………………小于1%
五、操作步驟
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出,置于室溫(20~25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數(shù)量的微孔板,將不用的微孔放入自封袋,保存于2~8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號(hào):將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本:加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20l/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中,再加入克倫特羅酶標(biāo)物50l/孔,再加入克倫特羅抗試劑80ul/孔輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反30min
6、洗板:小心揭開(kāi)蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液300l/孔,充分洗滌5次,每次間隔30s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)。
7、顯色:加入底物液A液50l/孔,再加底物液B液50l/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15~20min。
8、測(cè)定:加入終止液50l/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè),請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測(cè)定每孔OD值。(若無(wú)酶標(biāo)儀,則不加終止液用目測(cè)法可進(jìn)行判定)。
六、檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
試劑盒靈敏度:0.1ppb
樣本最低檢測(cè)限:
組織樣品………………………………………0.3ppb
尿液或血清樣品………………………………0.1ppb
飼料樣品……………………………………5ppb
回收率:
組織樣品………………………………………80±10%
尿液或血清樣品………………………………80±10%
飼料樣品…………………………………80±10%
精密度:試劑盒的變異系數(shù)均小于10%
七、注意事項(xiàng)
1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫(20~25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不成線(xiàn)性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、每加一種試劑前需將其搖勻。
4、反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
5、不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒;也不要使用過(guò)了有效期的試劑盒中的任何試劑,摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低;不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
6、儲(chǔ)存條件:保存試劑盒于2~8℃,不要冷凍,將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感,因此要避免直接暴露在光線(xiàn)下。
7、試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5)時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
8、在加入底物液A液和底物液B液后,一般顯色時(shí)間為15~20min即可。若顏色較淺,可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到30min(或更長(zhǎng)),但不得超過(guò)40min。反之,則減短反應(yīng)時(shí)間。
9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
八、貯藏條件及保存期
貯藏條件:保存試劑盒于2~8℃。
保存期:該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。