一、溫度對(duì)發(fā)酵的影響
微生物發(fā)酵所用的菌體絕大多數(shù)是中溫菌,如霉菌、放線菌和一般細(xì)菌。它們的最適生長(zhǎng)溫度一般在20~40℃。在發(fā)酵過程中,需要維持適當(dāng)?shù)臏囟,才能使菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的生成順利地進(jìn)行。
溫度對(duì)發(fā)酵有很大的影響。它會(huì)影響各種酶反應(yīng)的速率,改變菌體代謝產(chǎn)物的合成方向,影響微生物的代謝調(diào)控機(jī)制,影響發(fā)酵液的理化性質(zhì),進(jìn)而影響發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)特性和產(chǎn)物的生物合成。
溫度對(duì)化學(xué)反應(yīng)速度的影響常用溫度系數(shù)(Q10)(溫度每升高10℃,化學(xué)反應(yīng)速度所增加的倍數(shù))來(lái)表示。在不同溫度范圍內(nèi),Q10的數(shù)值是不同的,一般是2~3。而酶反應(yīng)速度與溫度變化的關(guān)系也完全符合此規(guī)律,也就是說(shuō),在一定范圍內(nèi),隨著溫度的升高,酶反應(yīng)速率也增加,但有一個(gè)最適溫度,超過這個(gè)溫度,酶的催化活力會(huì)下降。溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的酶反應(yīng)和代謝產(chǎn)物合成的酶反應(yīng)的影響往往是不同的。
有人考察了不同溫度(13~35℃)對(duì)青霉菌的生長(zhǎng)速率、呼吸強(qiáng)度和青霉素生成速率的影響,結(jié)果是,溫度對(duì)這三種代謝的影響是不同的。按照阿倫尼烏斯方程計(jì)算,青霉菌生長(zhǎng)的活化能E=34kJ/mol,呼吸活化能E=71kJ/mol,青霉素合成的活化能E=112kJ/mol。從這些數(shù)據(jù)得知:青霉素生成速率對(duì)溫度的影響最為敏感,微小的溫度變化,就會(huì)引起生成速率產(chǎn)生明顯的改變,偏離最適溫度就會(huì)引起產(chǎn)物產(chǎn)量發(fā)生比較明顯的下降,這說(shuō)明次級(jí)代謝發(fā)酵溫度控制的重要性。因此,溫度對(duì)菌體的生長(zhǎng)和合成代謝的影響是極其復(fù)雜的,需要考察它對(duì)發(fā)酵的影響。
溫度還能改變菌體代謝產(chǎn)物的合成方向。如在高濃度Cl-和低濃度Cl-的培養(yǎng)基中利用金霉素鏈霉菌NRRLB-1287進(jìn)行四環(huán)素發(fā)酵過程中,發(fā)酵溫度愈高,愈有利于四環(huán)素的合成,30℃以下時(shí)合成的金霉素增多,在35℃時(shí)就只產(chǎn)四環(huán)素,而金霉素合成幾乎停止。
溫度變化還對(duì)多組分次級(jí)代謝產(chǎn)物的組分比例產(chǎn)生影響。如黃曲霉產(chǎn)生的多組分黃曲霉毒素,在20℃、25℃和30℃下發(fā)酵所產(chǎn)生的黃曲霉毒素(aflatoxin)G1與B1的比例分別為3:1、1:2、1:1。又如赭曲霉在10~20℃發(fā)酵時(shí),有利于合成青霉素,在28℃時(shí)則有利于合成赭曲霉毒素A。這些例子,都說(shuō)明溫度變化不僅影響酶反應(yīng)的速率,還影響產(chǎn)物的合成方向(當(dāng)然,這也是酶反應(yīng))。據(jù)報(bào)道,溫度還能影響微生物的代謝調(diào)控機(jī)制,在氨基酸生物合成途徑中的終產(chǎn)物對(duì)第一個(gè)合成酶的反饋抑制作用,在20℃低溫時(shí)就比在正常生長(zhǎng)溫度37℃時(shí)抑制更嚴(yán)重。
除上述直接影響外,溫度還對(duì)發(fā)酵液的物理性質(zhì)產(chǎn)生影響,如發(fā)酵液的黏度、基質(zhì)和氧在發(fā)酵液中的溶解度和傳遞速率、某些基質(zhì)的分解吸收速率等,都受溫度變化的影響,進(jìn)而影響發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特性和產(chǎn)物的生物合成。
二、影響發(fā)酵溫度變化的因素
在發(fā)酵過程中,既有產(chǎn)生熱能的因素,又有散失熱能的因素,因而引起發(fā)酵溫度的變化。產(chǎn)熱的因素有生物熱(Q生物)和攪拌熱(Q攪拌);散熱因素有蒸發(fā)熱(Q蒸發(fā))、輻射熱(Q輻射)和顯熱(Q顯)。產(chǎn)生的熱能減去散失的熱能,所得的凈熱量就是發(fā)酵熱[Q發(fā)酵,kJ/(m3·h)],即Q發(fā)酵=Q生物+Q攪拌-Q蒸發(fā)-Q顯-Q輻射。這就是發(fā)酵溫度變化的主要因素,F(xiàn)將這些產(chǎn)熱和散熱的因素分述如下。
⒈生物熱(Q生物)
產(chǎn)生菌在生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生的熱能,叫做生物熱。營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)被菌體分解代謝產(chǎn)生大量的熱能,部分用于合成高能化合物ATP,供給合成代謝所需要的能量,多余的熱量則以熱能的形式釋放出來(lái),形成了生物熱。
生物熱的大小,是隨菌種和培養(yǎng)基成分不同而變化。一般來(lái)說(shuō),對(duì)某一菌株而言,在同一條件下,培養(yǎng)基成分愈豐富,營(yíng)養(yǎng)成分被利用的速度愈快,產(chǎn)生的生物熱就愈大。生物熱的大小還隨培養(yǎng)時(shí)間不同而不同:當(dāng)菌體處在孢子發(fā)芽和停滯期時(shí),產(chǎn)生的生物熱是有限的;進(jìn)入對(duì)數(shù)期,就釋放出大量的熱能,并與細(xì)胞的生成量成正比;在對(duì)數(shù)期以后,熱能就開始減少,并隨菌體逐步衰老而下降。因此,在對(duì)數(shù)期釋放的發(fā)酵熱最大,常作為發(fā)酵熱平衡的主要依據(jù)。例如,四環(huán)素發(fā)酵在20~50h時(shí)的發(fā)酵熱最大,最高值達(dá)29330kJ/(m3·h),其他時(shí)間的最低值約為8380kJ/(m3·h),平均值為16760kJ/(m3·h)。另外,還發(fā)現(xiàn)抗生素高產(chǎn)量批次的生物熱高于低產(chǎn)量批次的生物熱。這說(shuō)明抗生素合成時(shí)菌的新陳代謝十分旺盛。
生物熱的大小與菌體的呼吸強(qiáng)度有對(duì)應(yīng)關(guān)系,呼吸強(qiáng)度愈大,所產(chǎn)生的生物熱也愈大。在四環(huán)素發(fā)酵中,這兩者的變化是一致的,生物熱的高峰也是碳利用速度的高峰。有人已證明,在一定條件下,發(fā)酵熱與菌體的攝氧率成正比關(guān)系,即Q發(fā)酵=0.12。
⒉攪拌熱(Q攪拌)
發(fā)酵罐攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)引起的液體之間和液體與設(shè)備之間的摩擦所產(chǎn)生的熱量,即攪拌熱。攪拌熱可根據(jù)下式近似算出來(lái)。
⒊蒸發(fā)熱(Q蒸發(fā))
空氣進(jìn)入發(fā)酵罐與發(fā)酵液廣泛接觸后再排出,引起水分蒸發(fā)所需的熱能,即為蒸發(fā)熱。水的蒸發(fā)熱和廢氣因溫度差異所帶的部分顯熱(Q顯)一起都散失到外界。由于進(jìn)入的空氣溫度和濕度是隨外界的氣候和控制條件而變,所以Q蒸發(fā)和Q顯是變化的。
⒋輻射熱(Q輻射)
由于罐外壁和大氣間的溫度差異而使發(fā)酵液中的部分熱能通過罐體向大氣輻射的熱量,即為輻射熱。輻射熱的大小取決于罐內(nèi)溫度與外界氣溫的差值,差值愈大,散熱愈多。
由于Q生物、Q蒸發(fā)和Q顯,特別是Q生物在發(fā)酵過程中是隨時(shí)間變化的,因此發(fā)酵熱在整個(gè)發(fā)酵過程中也隨時(shí)間變化,引起發(fā)酵溫度經(jīng)常波動(dòng)。為了使發(fā)酵能在一定溫度下進(jìn)行,故要設(shè)法進(jìn)行控制。
三、溫度的控制
⒈最適溫度的選擇
最適發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長(zhǎng)、又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。但最適生長(zhǎng)溫度與最適生產(chǎn)溫度往往是不一致的。各種微生物在一定條件下,都有一個(gè)最適的溫度范圍。微生物種類不同,所具有的酶系不同,所要求的溫度不同。同一微生物,培養(yǎng)條件不同,最適溫度不同。如谷氨酸產(chǎn)生菌的最適生長(zhǎng)溫度為30~34℃,產(chǎn)生谷氨酸的溫度為36~37℃。在谷氨酸發(fā)酵的前期菌生長(zhǎng)階段和種子培養(yǎng)階段應(yīng)滿足菌體生長(zhǎng)的最適溫度。若溫度過高,菌體容易衰老。在發(fā)酵的中后期菌體生長(zhǎng)已經(jīng)停止,為了大量積累谷氨酸,需要適當(dāng)提高溫度。又如初級(jí)代謝產(chǎn)物乳酸的發(fā)酵,乳酸鏈球菌的最適生長(zhǎng)溫度為34℃,而產(chǎn)酸最多的溫度為30℃,但發(fā)酵速度最快的溫度最高達(dá)40℃。次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵更是如此,如在加有2%乳糖、2%玉米漿和適量無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中對(duì)青霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)黃青霉進(jìn)行發(fā)酵研究,測(cè)得菌體的最適生長(zhǎng)溫度為30℃,而青霉素合成的最適溫度僅為24.7℃。因此需要選擇一個(gè)最適的發(fā)酵溫度。
最適發(fā)酵溫度隨著菌種、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和菌體生長(zhǎng)階段不同而改變。理論上,整個(gè)發(fā)酵過程中不應(yīng)只選一個(gè)培養(yǎng)溫度,而應(yīng)根據(jù)發(fā)酵不同階段,選擇不同的培養(yǎng)溫度。在生長(zhǎng)階段,應(yīng)選擇最適生長(zhǎng)溫度;在產(chǎn)物生成階段,應(yīng)選擇最適生產(chǎn)溫度。發(fā)酵溫度可根據(jù)不同菌種,不同產(chǎn)品進(jìn)行控制。
有人試驗(yàn)青霉素變溫發(fā)酵,其溫度變化過程是,起初5h,維持在30℃,以后降到25℃培養(yǎng)35h,再降到20℃培養(yǎng)85h,最后又提高到25℃,培養(yǎng)40h放罐。在這樣條件下所得青霉素產(chǎn)量比在25℃恒溫培養(yǎng)提高了14.7%。又如四環(huán)素發(fā)酵,在中后期保持稍低的溫度,可延長(zhǎng)產(chǎn)物生產(chǎn)期,放罐前的24h,培養(yǎng)溫度提高2~3℃,就能使最后這一天的發(fā)酵單位增加率提高50%以上。這些都說(shuō)明變溫發(fā)酵產(chǎn)生的良好結(jié)果。但在工業(yè)發(fā)酵中,由于發(fā)酵液的體積很大,升降溫度都比較困難,所以在整個(gè)發(fā)酵過程中,往往采用一個(gè)比較適合的恒定培養(yǎng)溫度,使得到的產(chǎn)物產(chǎn)量最高,或者在可能條件下進(jìn)行變溫發(fā)酵。實(shí)際生產(chǎn)中,為了得到較高的發(fā)酵效率,獲得滿意的產(chǎn)物得率,往往采用二級(jí)或三級(jí)管理溫度。
⒉溫度的控制
工業(yè)生產(chǎn)上,所用的大發(fā)酵罐在發(fā)酵過程中一般不需要加熱,因發(fā)酵中釋放了大量的發(fā)酵熱,而需要冷卻的情況較多。利用自動(dòng)控制或手動(dòng)調(diào)整的閥門,將冷卻水通入發(fā)酵罐的夾層或蛇形管中,通過熱交換來(lái)降溫,保持恒溫發(fā)酵。如果氣溫較高(特別是我國(guó)南方的夏季氣溫),作為冷卻水的地表水溫度又高,致使冷卻效果很差,達(dá)不到預(yù)定的溫度,須采用冷凍鹽水進(jìn)行循環(huán)式降溫,以迅速降到最適發(fā)酵溫度。因此大工廠需要建立冷凍站,提高冷卻能力,以保證發(fā)酵在最適溫度下進(jìn)行。