一
核酸檢測
所有生物除朊病毒外都含有核酸,核酸包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。新型冠狀病毒(2019-nCoV)屬于Beta冠狀病毒屬(Betacoronavirus),該病毒是蛋白包裹的單鏈正鏈RNA病毒,寄生和感染高等動物(包括人)。病毒中特異性RNA序列是區(qū)分該病毒與其它病原體的標(biāo)志物,新型冠狀病毒出現(xiàn)后,我國科學(xué)家已經(jīng)成功發(fā)現(xiàn)了新型冠狀病毒中的特異性核酸序列。如疑似患者樣本中能檢測到新型冠狀病毒的特異性核酸序列,則認(rèn)為該患者可能被新型冠狀病毒感染。新型冠狀病毒常用的核酸診斷方法有兩種:病毒核酸特異基因檢測和病毒基因組測序。最常見的檢測新型冠狀病毒特異性核酸序列的方法是熒光定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。由于新型冠狀病毒是RNA病毒,試劑盒檢測基本都采用反轉(zhuǎn)錄加實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR),擴增病原體的核酸 (RNA) ,同時通過熒光探針實時檢測擴增產(chǎn)物。在PCR反應(yīng)體系中,包含一對特異性引物以及一個Taqman探針,該探針為一段特異性寡核苷酸序列,兩端分別標(biāo)記了報告熒光基團和淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;如反應(yīng)體系存在靶序列,PCR反應(yīng)時探針與模板結(jié)合,DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解,報告基團與淬滅基團分離,發(fā)出熒光。每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子產(chǎn)生。熒光定量PCR儀能夠監(jiān)測出熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)與病毒核酸濃度有關(guān),病毒核酸濃度越高,Ct值越小。不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品會依據(jù)自身產(chǎn)品的性能確定本產(chǎn)品的陽性判斷值。
由于每個RT-PCR反應(yīng)需要2個小時左右才出結(jié)果,因此,試劑盒在開發(fā)時一般都針對病毒序列中高度保守的2-3個序列比如編碼replicase(復(fù)制酶)或者necleocapsid(核蛋白衣,核鞘)的核酸序列設(shè)計引物,但是各個方法用的序列都不完全相同。一些方法使用multiplex,也就是把多個目標(biāo)序列在同一反應(yīng)管中擴增;另一些采用分步,先用一個目標(biāo)序列篩查,陽性后再用另一個序列確認(rèn),這樣可以有效縮短整個流程時間,加快檢測速度。另外RNA病毒變異很快,用多個保守目標(biāo)序列可以防止病毒變異造成的假陰性。
目前批準(zhǔn)產(chǎn)品均基于新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框1a/b(open reading frame 1ab,ORF1ab)、包膜蛋白(Envelope protein,E)和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,N)進(jìn)行選擇。不同產(chǎn)品的檢測原理基本一致,但是其引物、探針設(shè)計存在不同,有單靶區(qū)段(ORF1ab)、雙靶區(qū)段(ORF1ab、N蛋白)、三靶區(qū)段(ORF1ab、N蛋白和E蛋白)的檢測和判讀差別。一般檢測位于病毒ORF1ab和N基因上的兩個靶標(biāo),同一份標(biāo)本需滿足雙靶標(biāo)陽性或重復(fù)檢測為單靶標(biāo)陽性或兩種標(biāo)本同時滿足單靶標(biāo)才能確認(rèn)SARS-CoV-2病毒核酸陽性。
檢測程序需要經(jīng)過五個步驟,取樣、留樣、保存、核酸提取、上機檢測。首先根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行樣本采集,樣本類型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等。由于RNA易降解,因此,采集樣本時使用無RNA酶的拭子和無RNA酶的儲存管。獲得患者樣本后,需盡快進(jìn)行檢測,如無法立即檢測需要進(jìn)行低溫封裝,并送到專門的檢測機構(gòu)進(jìn)行檢測。檢測機構(gòu)收到樣本后,對樣本進(jìn)行核酸提取,核酸提取試劑應(yīng)使用批準(zhǔn)產(chǎn)品說明書中指定的核酸提取試劑盒。最后是熒光PCR核酸檢測,也就是上機器檢測,將提取物進(jìn)行熒光PCR擴增反應(yīng),需要70—80分鐘。
二
抗體檢測
病毒侵入人體后,人體會產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行防御。免疫球蛋白是機體在抗原物質(zhì)刺激下由漿細(xì)胞產(chǎn)生的一類能與抗原特異性結(jié)合的血清活性成分,根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原特異性的不同,將免疫球蛋白分為五類:IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。
抗原初次進(jìn)入機體后,經(jīng)過一定的潛伏期產(chǎn)生漿細(xì)胞并合成分泌抗體。最早出現(xiàn)的是IgM,但該抗體維持時間短、濃度低、親和力較低,在血中持續(xù)數(shù)日至數(shù)周,是急性期感染的診斷指標(biāo);在IgM接近消失時,IgG的含量達(dá)到高峰,IgG產(chǎn)生晚,但濃度高、維持時間長、親和力高,血清IgG陽性提示感染中后期或既往感染,當(dāng)數(shù)月乃至數(shù)年再次接觸相同抗原時,最初原抗體量稍有下降,可能是由于一部分原有抗體被再次進(jìn)入的抗原所結(jié)合,從而暫時降低了抗體含量,但短期內(nèi)抗體含量迅速增加,可能比原來抗體含量高數(shù)倍至數(shù)十倍,以IgG為主,在體內(nèi)持續(xù)時間也長,IgM很少增加。本次疫情中,通過研究者對COVID-19患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),病毒侵入人體后,IgM抗體大約需要5-7天產(chǎn)生,IgG抗體在10-15天時產(chǎn)生。2020年3月4日,國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布了最新版本的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》在原有診療方案的基礎(chǔ)上增加了血清學(xué)檢測,作為確診病例和疑似病例的診斷依據(jù)之一。血清學(xué)檢測便是通過檢測血液樣本中的特異性抗體IgM和IgG的存在及含量,來間接判斷體內(nèi)有無病毒及病毒感染情況。目前臨床中常用的抗體血清學(xué)檢測方法有3種:酶聯(lián)免疫吸附試驗法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、膠體金免疫層析法。
ELISA是一種結(jié)合抗原、抗體特異性反應(yīng)和酶對底物高效催化作用的高敏感性免疫學(xué)實驗技術(shù)。測定時,受檢的標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。固相上的酶量與標(biāo)本中的受檢物質(zhì)的量成比例。加入酶反應(yīng)底物后,底物被催化成有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)。所以,可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行半定量或定性分析。該檢測方法靈敏度較高,載體標(biāo)準(zhǔn)化難度較低,但檢測速度慢、易污染、步驟較為繁瑣。在實際應(yīng)用中,需要根據(jù)抗原抗體的特性設(shè)計不同的檢測法,目前有雙抗體夾心法、免疫抑制法、競爭法、直接法&間接法等類型。
是以膠體金為示蹤標(biāo)志物,應(yīng)用于抗原抗體檢測的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù),氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下,可聚合成一定大小的金顆粒,形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài),故稱膠體金。膠體金試紙,是將膠體金標(biāo)記的生物大分子在PVC材質(zhì)的試紙固定,留加樣孔,并設(shè)檢測線和質(zhì)量控制線。在加樣孔上加入樣品后,再滴加液體介質(zhì),試紙上進(jìn)行層析。根據(jù)試紙上的免疫反應(yīng)發(fā)生結(jié)果,即膠體金位置是否有紅色條帶出現(xiàn)判斷檢測結(jié)果。
該方法無需特殊處理標(biāo)本,僅需一滴血即可在15 min內(nèi)通過肉眼觀察獲取檢測結(jié)果,突破了現(xiàn)有檢測技術(shù)對人員、場所的限制,縮短檢測時間,操作方便快速,在基層醫(yī)療單位及現(xiàn)場檢測中廣泛使用。目前針對新型冠狀病毒,已經(jīng)報道的有兩種膠體金試紙,一種是檢測新型冠狀病毒的抗原-雙抗體夾心法,另一種是檢測患者血液里特異性針對新型冠狀病毒的IgM抗體-IgM捕捉法。在疫情爆發(fā)期,需要大規(guī)模做陽性檢測時,適合使用總抗檢測,同時聯(lián)卡操作也比較簡單,只需要操作一次,而分開檢測需要滴加兩次樣,用兩次卡。
化學(xué)發(fā)光免疫分析法是將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合,用于各種抗原、抗體、激素等檢測。該法靈敏度高于 ELISA,具有特異性強、線性范圍寬、結(jié)果穩(wěn)定、操作簡化等特點,廣泛應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測。但是該方法對設(shè)備、操作、使用環(huán)境的要求比較高,使用時需要配套的化學(xué)發(fā)光儀器。
抗體檢測的靈敏度和特異度:靈敏度反映診斷試驗檢出感染者的能力,若過低,會出現(xiàn)較多假陰性結(jié)果,影響疾病的診斷、干預(yù)和預(yù)后,嚴(yán)重可導(dǎo)致患者過早死亡;特異度衡量診斷試驗正確判斷非感染者的能力,若過低,則會出現(xiàn)較多假陽性結(jié)果,導(dǎo)致醫(yī)療資源的浪費,并造成患者及群眾的焦慮和恐慌。因此,具有較高靈敏度和特異度是抗體檢測技術(shù)的應(yīng)用基礎(chǔ)。
三
不同檢測方法優(yōu)缺點對比
與抗體血清學(xué)檢測相比,核酸檢測能夠檢測到處于窗口期的患者,及早發(fā)現(xiàn)感染者,是新型冠狀病毒檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但是對檢測設(shè)備或平臺要求較高,高靈敏度的RT-PCR儀價格昂貴,對實驗室的潔凈度和操作人員要求也較高。此外,核酸檢測耗時較長,考慮到樣本運輸、樣本積壓的情況,通常最快24小時才可以報告結(jié)果。
與核酸檢測相比,抗體血清學(xué)檢測的血液標(biāo)本更易獲取且標(biāo)本質(zhì)量有保證、操作簡單快捷、很大程度上降低了醫(yī)護人員在標(biāo)本采集和檢測過程中被感染的風(fēng)險、更易于基層實驗室展開篩查工作等。如果說核酸檢測病毒的核糖核酸(RNA),是病毒存在的直接證據(jù),那么抗體檢測的就是患者血液中被刺激產(chǎn)生的抗體,是間接證據(jù),對臨床有提示作用。當(dāng)核酸檢測陰性時,將IgM和IgG抗體檢測增加進(jìn)去,可以彌補核酸檢測容易造成漏診的缺點。
目前市場上主流的抗體檢測方法學(xué)是化學(xué)發(fā)光,但化學(xué)發(fā)光平臺對設(shè)備、操作、使用環(huán)境的要求比較高。對比核酸檢測,化學(xué)發(fā)光的核心優(yōu)勢就是取樣及操作簡易,但沒有快速檢測的優(yōu)勢。針對于普通篩查或者說針對于非發(fā)達(dá)國家,膠體金檢測方法對人員、場地、設(shè)備要求都非常低,適用于大規(guī)模的快速檢測。國際企業(yè)如羅氏、雅培等在膠體金方面是沒有技術(shù)儲備的,實際上全球的膠體金檢測(包括新冠肺炎、傳染病、流感、瘧疾、性病等)大部分的供應(yīng)量還是在中國。
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