摘要 概述了目前應(yīng)用于植物抗蟲(chóng)基因工程的兩類(lèi)主要基因，即蘇云金桿菌毒蛋白基因和蛋白酶抑制劑基因的分類(lèi)、殺蟲(chóng)機(jī)理以及基因改造后應(yīng)用于抗蟲(chóng)基因工程的研究近況，同時(shí)探討了抗蟲(chóng)基因工程存在問(wèn)題及解決途徑，提出了今后可能的發(fā)展方向。
0、前言
蟲(chóng)害是制約農(nóng)作物高產(chǎn)的重要因素，世界每年因蟲(chóng)害造成的損失約占農(nóng)作物總產(chǎn)量的15%以上�；瘜W(xué)農(nóng)藥的施用在減少蟲(chóng)害的同時(shí)引起一系列副作用，如提高成本、污染環(huán)境、誘導(dǎo)害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性、引起次要害蟲(chóng)的大發(fā)生等。而通過(guò)基因工程手段培育抗蟲(chóng)新品種 (系)可從根本上解決問(wèn)題，對(duì)哺乳動(dòng)物和一些有益昆蟲(chóng)不產(chǎn)生毒害作用，且不造成環(huán)境污染，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前全世界最常改良的性狀中抗蟲(chóng)占第二位(24%)，到1998年已商業(yè)化的6類(lèi)性狀中抗蟲(chóng)占15%，抗蟲(chóng)和抗除草劑占10%。人們已從細(xì)菌中、植物本身以及昆蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離到許多抗蟲(chóng)基因，有許多抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物正在進(jìn)行田間試驗(yàn)，并有一些品種已商品化。迄今發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于提高植物抗蟲(chóng)性的基因主要有兩類(lèi):一類(lèi)是從細(xì)菌中分離出來(lái)的抗蟲(chóng)基因，如蘇云金桿菌毒蛋白基因(Bt基因)、異戊基轉(zhuǎn)移酶基因(ipt)，另一類(lèi)是從植物中分離出來(lái)的抗蟲(chóng)基因，如蛋白酶抑制劑基因(PI基因)、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因等。其中Bt基因和PI基因在農(nóng)業(yè)上利用最廣，本文對(duì)這兩類(lèi)基因的轉(zhuǎn)基因工程研究作一簡(jiǎn)要綜述。
1、Bt毒蛋白基因
1．l Bt毒蛋白的殺蟲(chóng)機(jī)理
Bt是蘇云金桿菌Baciius thuringiensis的簡(jiǎn)稱(chēng)，是一種革蘭氏陽(yáng)性土壤芽胞桿菌。通過(guò)克隆技術(shù)確定Bt基因位于30~150MD大小不同的質(zhì)粒上，其中毒性區(qū)間位于該序列N端29~607個(gè)編碼區(qū)，C端有高度的保守性，對(duì)穩(wěn)定晶體蛋白結(jié)構(gòu)可能起著重要作用。Bt殺蟲(chóng)活性源于芽胞形成時(shí)產(chǎn)生的殺蟲(chóng)結(jié)晶蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)或蘇云金桿菌毒蛋白(Bt toxic protein)，其中應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要是δ內(nèi)毒素。已知δ內(nèi)毒素為130~160KD的多肽，在伴孢晶體內(nèi)是以原毒素(protoxin)的形式存在，經(jīng)體外堿解或在昆蟲(chóng)腸道內(nèi)被蛋白酶水解成55~70KD或更小的多肽，與敏感昆蟲(chóng)中腸道上皮紋緣細(xì)胞 (brushborder membrance)上的特異受體位點(diǎn)結(jié)合，引起并破壞紋緣膜細(xì)胞滲透壓平衡，使細(xì)胞裂解，殺死昆蟲(chóng)。
1．2 Bt霉蛋白基因分類(lèi)
自1901年發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌以來(lái)，現(xiàn)已分離出4萬(wàn)多個(gè)Bt菌種，報(bào)道了51個(gè)血清型，50多個(gè)亞種，已克隆出60多個(gè)毒素基因。不同基因型殺蟲(chóng)譜不同，毒蛋白的大小及形狀也不一樣。根據(jù)殺蟲(chóng)譜的不同，將殺蟲(chóng)基因分成六大類(lèi)，統(tǒng)稱(chēng)為cry基因，用羅馬數(shù)字I、II、III、IV等來(lái)命名，分別代表幾種殺蟲(chóng)范圍。在每一類(lèi)型下根據(jù)氨基酸序列的同源性，又分為A，B，C等不同的基因型。在同一基因型下根據(jù)限制性?xún)?nèi)切酶的酶譜和分子量的大小，又分為a，b，c等不同的基因亞型。其分類(lèi)如下:
cry I基因型編碼對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)有毒殺作用的菱形伴孢晶體蛋白，約30~140KD，在昆蟲(chóng)中腸內(nèi)降解為60~70KD的多肽，在cry I基因間，氨基酸同源性為82%~90%的歸為cry I A;55%~71%的歸為cry I A基因中，根據(jù)限制性?xún)?nèi)切酶的酶譜和分子量的大小，又分為:cry I A (a)，4.50kb;cry I A (b)，5.30kb;cry I A (c)，6.60kb亞類(lèi)基因。Cry II基因通常編碼對(duì)鱗翅目和雙翅目昆蟲(chóng)有毒殺作用的立方體伴孢晶體蛋白，約65KD。而cry II B只對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)有毒性，它們之間的同源性達(dá)80%左右。cry III基因編碼對(duì)鞘翅目昆蟲(chóng)有特異毒殺作用的長(zhǎng)方形伴孢晶體，約72KD。Cry III A基因與cry I和cryIV基因的毒性核心5' 端編碼區(qū)有同源性，與3'端編碼區(qū)有所不同，如果將3'端去掉，將失去殺蟲(chóng)活性。Cry IV基因編碼對(duì)雙翅
目昆蟲(chóng)有特異毒性的橢園形伴孢晶體。cry IV A，135KD;cry IV B，128KD;cry IV C，78KD;cry IV D，72KD，cry IV A和cry IV B基因在結(jié)構(gòu)上與cry I相似，毒性核心區(qū)段為53~78KD，位于原毒素蛋白的N端。
1．3 Bt毒蛋白基因的修飾、改造及應(yīng)用
雖然早期的轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因植物或多或少都對(duì)昆蟲(chóng)有些抗性，但殺蟲(chóng)蛋白在植株上的表達(dá)量很低 (占全部可溶性蛋白的0.001%以下)，抗蟲(chóng)效果不理想。其主要原因是目前使用的殺蟲(chóng)晶體蛋白大多來(lái)源于細(xì)菌，與高等植物結(jié)構(gòu)基因正常的DNA序列相比，Bt基因含有較多的AT堿基和ATTTA重復(fù)序列。AT富含區(qū)在高等植物中被認(rèn)為是不能表達(dá)的內(nèi)含子，ATTTA重復(fù)序列的mRNA的穩(wěn)定性差，二者都不能在高等植物中編碼。此外，Bt基因中的偏愛(ài)密碼子與植物中的不同，以及共中存在的一些不穩(wěn)定元件如poly(A)信號(hào)序列、切割序列、終止序列等都直接影響著Bt基因在植物中的mRNA特性。為此，Monsanto公司從兩條途徑對(duì)原基因進(jìn)行了改造。
第一條途徑是改進(jìn)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的啟動(dòng)子，加入帶有SV40復(fù)制增強(qiáng)子區(qū)的35S啟動(dòng)子或重復(fù)的強(qiáng)化表達(dá)區(qū) (duplicated enhanced region)，發(fā)現(xiàn)改建后的載體表達(dá)量比原先提高了5~10倍 (Perlak等，1990)。
第二條途徑是根據(jù)植物偏愛(ài)的密碼子對(duì)野生型(WT)Bt基因cry I A(b)進(jìn)行部分改造或人工全合成，Perlak等對(duì)WT cryIA(b)AT富含區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變，改變其中63個(gè)堿基對(duì)，AT含量由63%下降至59%，而ATTTA重復(fù)序列也從13個(gè)減少至7個(gè)，部分改造后的基因稱(chēng)為PMcryIA(b)。PMcryIA(b)基因在轉(zhuǎn)化的煙草和番茄中的表達(dá)量為1~l0ng/50ug植物可溶總蛋白，比WTcryIA(b)在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量(<1ng/50ug)提高了10倍。進(jìn)一步在不改變編碼的氨基酸序列的前提下，幾乎更換掉WT基因中的所有不穩(wěn)定元件，同時(shí)盡可能將其中的密碼子換成植物優(yōu)化密碼子，AT含量下降至51%，去掉所有ATTTA序列。全合成的基因稱(chēng)為Fncry I A(b)用其轉(zhuǎn)化煙草 番茄，10%以上的轉(zhuǎn)化植株表達(dá)量達(dá)30-100n/50ug植物可溶總蛋白，最高的可達(dá)100－150ng/50ug，比WtcryIA(b)的表達(dá)量提高50－100倍，表現(xiàn)較強(qiáng)的殺蟲(chóng)效果。
近年來(lái)人們?cè)冢?/span>t毒蛋白基因的修飾與改造、表達(dá)載體的構(gòu)建、植物組織化、抗蟲(chóng)植物的培育等方面作了大量工作（Krattiger,1997）。我國(guó)也從1991年起開(kāi)始了Ｂt cry I A殺蟲(chóng)基因的部分改造或全合成，并導(dǎo)入棉花、煙草、甘藍(lán)等25種以上植物獲得成功。目前全世界已獲得50多種不同的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物，技術(shù)趨向成熟，成果向商品化、實(shí)用化階段深入，并開(kāi)展大規(guī)模的田間推廣試驗(yàn)。從1995年起，cry I A 類(lèi)轉(zhuǎn)基因玉米、棉花和馬鈴薯已商品化，性狀有單基因的抗玉米螟、抗棉鈴蟲(chóng)和抗馬鈴薯甲蟲(chóng)，還有玉米和棉花的多基因抗蟲(chóng)＋抗除草劑必狀（表1）。
表1 轉(zhuǎn)Bt基因植物
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工程植物 Engineering plants |
目的基因 Target gene |
轉(zhuǎn)化方法 Transformation method |
參考文獻(xiàn) Reference |
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煙草 Tobacco |
Cry I A(a)（抗煙草天蛾） Cry I A(b)（抗煙草天蛾） Cry I A(c)（抗煙草青蟲(chóng)） Bt(獲純合體株系Ｄ8-14，Ｄ19-8) Cry I A(b)（切去3’端，留640序列） |
農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) |
Barton等 1987 Vacek等 1987 田穎川等 1991 李太元等 1994 Fischhott等 1987 |
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番茄 Tomato |
Cry I A(b)(抗口科鱗翅目) Bt（抗番茄果蟲(chóng)，番茄蠹蛾） Cry I a(b)（減少Ａ＋Ｔ含量） Bt CMV-CP |
農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) |
Delannay等 1989 Smith等 1990 Perlak等 1991 梁小友等 1994 |
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馬鈴薯 Potato |
Cry III A CryIII A Cry I A(c) |
農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) |
Cheng等 1992 Oerlak 1993 Ebora 1994 |
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棉花 Cotton |
Bt(轉(zhuǎn)原生質(zhì)體) Bt（下胚軸NPT II Kan’） Bt |
農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) |
El-Hiateny等 1990 Umbeck等 1991 Benedict等 1992 |
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粳稻 Japonica rice |
Cry I A (抗稻縱葉卷螟) |
電擊法（原生質(zhì)體） |
Fujimoto等 1993 |
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水稻 Rice |
Bt Cry I A(b)（未見(jiàn)抗蟲(chóng)性報(bào)道） Cry I A(b) Cry I A(b) Cry I A(c) |
ＰＥＧ法（ＰＢＩ121） 花粉管通道法 基因槍法（胚性愈傷） 農(nóng)桿菌介導(dǎo) |
楊虹等 1989 謝道昕等 1991 許新萍等 1997 成雄鷹 1998 |
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秈稻 Indica rice |
Cry I A(b) |
基因槍法 |
Wunnj等 1996 |
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秈稻和粳稻 Indica and Japonica rice |
Cry I A(b)（三化螟） |
基因槍法 |
Datta等 1998 |
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玉米 Maize |
Cry I A(b) Bt、bar Bt Bt |
基因槍法 子房注射 超聲波 基因槍法 |
Koziel等 1993 丁群星等 1993 張宏等 1993 王國(guó)英等 1993 |
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大豆 Soybean |
Bt（未見(jiàn)殺蟲(chóng)效果報(bào)道） Bt |
農(nóng)桿菌介導(dǎo)（LBA4404） 侵染子葉節(jié) |
Parrott等 1994 徐香玲等 1997 |
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蘋(píng)果 Apple |
Bt |
農(nóng)桿菌介導(dǎo) |
程家勝等 1994 |
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甘蔗 Sugarcane |
Cry I A(c)（抗非洲蔗螟） |
農(nóng)桿菌介導(dǎo) |
Fitch等 1996 |
2、蛋白酶抑制劑基因（PI基因）
PI是自然界最為豐富的蛋白質(zhì)之一，存在于絕大多數(shù)生物體尤其是許多植物的貯藏器官，如種子和塊莖中，是一類(lèi)天然的抗蟲(chóng)物質(zhì)，與前述蘇云金桿菌相比，具有抗蟲(chóng)譜廣、對(duì)人畜無(wú)副作用及昆蟲(chóng)不易產(chǎn)生耐受性等優(yōu)點(diǎn)（Gatehouse,1988）。在植物界，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近10個(gè)蛋白酶抑制劑家族，與抗蟲(chóng)基因工程關(guān)系最密切、研究最深入的是絲氨酸蛋白酶抑制劑，基中最主要的是胰蛋白酶抑制劑。因?yàn)榻^大多數(shù)昆蟲(chóng)所利用的正是這一類(lèi)消化酶，而植物細(xì)胞基本沒(méi)有這種酶，或含量甚微。PI同昆蟲(chóng)消化道內(nèi)的蛋白消化酶形成復(fù)合物，阻斷或削弱蛋白酶的水解形成復(fù)合物，阻斷或削弱蛋白酶的水解作用，使昆蟲(chóng)厭食或消化不良致死，從而達(dá)到抗蟲(chóng)目的。
目前已從豇豆、馬鈴薯、番茄、大豆、玉米等植物中分離純化出多種蛋白酶抑制劑基因或cDNA克隆。主要有豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（CpTI基因）、馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑基因（PTI基因）、玉米半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因（CPI基因）以及大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因（SKTI基因）等。比較不同來(lái)源的各種蛋白酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)CpTI抗蟲(chóng)效果較為理想，其抗蟲(chóng)范圍廣，對(duì)鱗翅目、鞘翅目、直翅目等幾乎所有昆蟲(chóng)都有殺傷作用，而且其作用位點(diǎn)在酶的活性中心，突變的可能性小，昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性突變的可能性幾乎沒(méi)有，目前已應(yīng)用于抗蟲(chóng)煙草、水稻、大豆，但由于其表達(dá)能力不夠強(qiáng)，應(yīng)用暫時(shí)受到限制。1997年高越峰、朱禎等人從未成熟的大豆子葉中分離出SKTI基因，為多基因家族，可抑制不同來(lái)源的胰蛋白酶活性，尤其對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)有較強(qiáng)抑制作用，且SKTI對(duì)胰蛋白酶活性的抑制能力明顯高于CpTI，顯示出較好的應(yīng)用前景。表2列出蛋白酶抑制劑基因主要應(yīng)用實(shí)例。
表2 轉(zhuǎn)蛋白酶抑制劑基因植物
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工程植物 Engineering plants |
目的基因 Target gene |
轉(zhuǎn)化方法 Transformation method |
參考文獻(xiàn) Reference |
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煙草 Tobacco 水稻 Rice |
CpTI PTI CpTI SKTI（抗棉鈴蟲(chóng)） CpTI（抗二化螟、三化螟） CPI（抗線蟲(chóng)） CPI（抗玉米象） |
農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 直接轉(zhuǎn)化 基因槍法 基因槍法 |
Hilder等 1987 Thornburg等 1987 劉春明等 1992 高越峰等 1998 莽克強(qiáng)等 1993 Vain等 1994 Kentaro等 1996 |
3、抗蟲(chóng)基因工程潛在的問(wèn)題、解決途徑及展望
伴隨抗蟲(chóng)基因工程進(jìn)展，其在應(yīng)用方面潛在的問(wèn)題也日益顯露。
首先是昆蟲(chóng)對(duì)Bt毒蛋白產(chǎn)生抗性的問(wèn)題。原因之一：根據(jù)Bt毒蛋白的殺蟲(chóng)機(jī)理，在長(zhǎng)期選擇壓力下，昆蟲(chóng)紋緣膜細(xì)胞上的受體位點(diǎn)會(huì)發(fā)生改變，使晶體蛋白不能與紋緣膜細(xì)胞上的受體位點(diǎn)結(jié)合，失去毒殺作用，結(jié)果昆蟲(chóng)就產(chǎn)生抗生。為此，可以采取以下策略，(1)將不同殺蟲(chóng)機(jī)理的殺蟲(chóng)蛋白基因;如具有廣譜抗蟲(chóng)特點(diǎn)的CpTI基因以及其他多肽毒素基因結(jié)合Bt基因轉(zhuǎn)化植物來(lái)抑制昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性。(2)采用誘導(dǎo)型或組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子與Bt毒蛋白基因構(gòu)成嵌合基因，獲得特異性表達(dá)的抗蟲(chóng)品種。使Bt基因只在害蟲(chóng)侵害時(shí)或者只在植物易受害蟲(chóng)侵害的部位或者只在一定的條件下 (如化學(xué)調(diào)節(jié)劑)高效表達(dá)，以減少耐受性昆蟲(chóng) 的發(fā)展。(3)把高劑量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物混合播種，使在Bt植株上具有純合抗性基因的抗性昆蟲(chóng)與非轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)易感昆蟲(chóng)交配，它們的后代成為雜合體，這樣可以去除昆蟲(chóng)產(chǎn)生的抗性基因，防止抗性等位基因在昆蟲(chóng)群體中固定。原因之二：Bt毒蛋白的抗蟲(chóng)譜較窄，某一特定的毒蛋白只對(duì)某一種或幾種害蟲(chóng)具有毒殺作用，害蟲(chóng)易對(duì)其產(chǎn)生抗性。對(duì)此可同時(shí)使用兩個(gè)以上的Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)化植物。不同的Bt毒蛋白，根據(jù)與竺定昆蟲(chóng)中腸紋緣膜細(xì)胞不同受體位點(diǎn)的結(jié)合程度，分為競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 (competitively binding)和非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 (noncompetitively binding)蛋白，如果兩種晶體蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合昆蟲(chóng)中腸全部受體位點(diǎn)，就稱(chēng)為競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合毒蛋白;如果與第一種毒蛋白結(jié)合的受體中有一個(gè)或多個(gè)不為第二種蛋白所競(jìng)爭(zhēng)，反之亦然，那么，對(duì)該昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，這兩上毒蛋白都是非競(jìng)爭(zhēng)的。將編碼非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合毒蛋白的2個(gè)或2個(gè)以上基因同時(shí)導(dǎo)入植物，能在很大程度上延緩害蟲(chóng)所產(chǎn)生的抗性。
第二個(gè)問(wèn)題是目前Bt毒蛋白基因在轉(zhuǎn)基因植物體中的表達(dá)水平普遍較低，存在基因“沉默”和甲基化現(xiàn)象，不能有效地毒殺害蟲(chóng)�；虺聊c目的基因在受體植物中的甲基化狀況、拷貝數(shù)、插入受體染色體位點(diǎn)及是否與受體植物中有同源基因等因素有關(guān)。目前主要采取以下措施來(lái)克服基因沉默現(xiàn)象；(1)避免多拷貝外源基因整合到受體基因組中，如利用Ac/Ds轉(zhuǎn)化載體、雙元細(xì)菌人造染色體載體、構(gòu)建核基質(zhì)支架附著區(qū)載體系統(tǒng)。(2)用具有特殊功能的啟動(dòng)子與增強(qiáng)子調(diào)控。(3)在有性世代后代中篩選單拷貝轉(zhuǎn)基因個(gè)體。（4）繼續(xù)深入研究DNA的空間結(jié)構(gòu)以及各種調(diào)控因子和環(huán)境因子對(duì)轉(zhuǎn)基因的影響。Jaquet等分析至少有三種因素影響殺蟲(chóng)活性:毒素的來(lái)源、晶體的溶解性和昆蟲(chóng)對(duì)毒素的內(nèi)在敏感性，昆蟲(chóng)對(duì)毒素的 內(nèi)在敏感性至少還與中腸液pH、蛋白酶活性和毒素受體的類(lèi)型、數(shù)量有關(guān)。Bt毒蛋白有134個(gè)亞類(lèi)，它們一級(jí)結(jié)構(gòu)的差異以及昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞上的受體是影響殺蟲(chóng)晶體蛋白毒力和殺蟲(chóng)特異性的兩個(gè)重要因素。隨著轉(zhuǎn)基因沉默機(jī)理研究的不斷深入，這種現(xiàn)象最終必將會(huì)得到克服。
抗蟲(chóng)植物基因工程是一項(xiàng)應(yīng)用性極強(qiáng)的研究，它使短時(shí)間內(nèi)培育出抗蟲(chóng)品種成為可能。同時(shí)正在進(jìn)行田間試驗(yàn)的性狀中，多基因抗蟲(chóng)性狀也屢次出現(xiàn)，將Bt基因、特殊的抗病基因、抗除草劑基因及優(yōu)良品質(zhì)基因集聚于同一品種。相信不久的將來(lái)，會(huì)有越來(lái)越多的多基因抗蟲(chóng)品種問(wèn)世。