沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，其病原沙門氏菌屬腸道細(xì)菌科，包括那些引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌。它們除可感染人外，還可感染很多動(dòng)物包括哺乳類、鳥、爬行類、魚、兩棲類及昆蟲。人畜感染后可呈無(wú)癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病，它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力。
蛋、家禽和肉類產(chǎn)品是沙門氏菌病的主要傳播媒介，感染主要取決于沙門氏菌的血清型和食用者的身體狀況，受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個(gè)體。根據(jù)國(guó)際慣例，要求對(duì)易受沙門氏菌污染的食品進(jìn)行分類管理，以使大多數(shù)食物不含沙門氏菌，從而有效預(yù)防沙門氏菌病。為此，人們?cè)谔剿魃抽T氏菌檢測(cè)方法的過程中，作出了不懈的努力，現(xiàn)將有關(guān)進(jìn)展報(bào)告如下，并介紹兩種快速檢測(cè)沙門氏菌的試劑盒。
自19世紀(jì)后期，沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原以來(lái)，檢測(cè)方法學(xué)都是建立在采取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基礎(chǔ)上。此后的60年間，用于從食品中分離沙門氏菌的方法實(shí)質(zhì)上與那些用于臨床病料的方法是相同的。但至少有三個(gè)因素限制了用于臨床病料的方法應(yīng)用在食品分析上。第一，通常，沙門氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性質(zhì)會(huì)干擾病原的檢測(cè)，例如，某些食品中固有菌群可能處在一個(gè)很高的水平，從而影響特定細(xì)菌的選擇性分離和鑒定；第三，與臨床病料不同的是，經(jīng)過加工的食品，由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用，其中的沙門氏菌受到了尚不致命的損傷或稱“致傷”。這就形成了一個(gè)具有不同生長(zhǎng)特性的細(xì)菌群。這種現(xiàn)象對(duì)那些希望從食物樣品中分離出沙門氏菌的食品分析家來(lái)說(shuō)有很大影響，因?yàn)樵谶x擇培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)“致傷”的沙門氏菌通常是以細(xì)菌死亡和試驗(yàn)失敗而告終。為克服這些困難，人們建立了一種簡(jiǎn)單的微生物增殖步驟，專門針對(duì)以食品為傳播載體的病原。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時(shí)，需要4～7天才能完成。因此，在需要及時(shí)、快速評(píng)價(jià)食品中微生物的安全性時(shí)，通常不被采用。隨著DNA和抗體技術(shù)的發(fā)展，近10～15年間發(fā)展了無(wú)數(shù)改進(jìn)的方法，其中許多可以在48h內(nèi)檢出沙門氏菌，這些方法通稱為快速檢測(cè)。
1 傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法
用于沙門氏菌分析的傳統(tǒng)方法是食物樣品分步增菌，以增加病原的可檢出率，這種培養(yǎng)方法總體可分4個(gè)不同階段或步驟。第一步(預(yù)增菌)，將樣品加到一種高營(yíng)養(yǎng)、無(wú)選擇性的培養(yǎng)基中，溫度37℃，使那些“致傷”的細(xì)菌復(fù)蘇及使所有微生物生長(zhǎng)。雖然緩沖胨水被建議常規(guī)使用(由于其可保持溶液pH值穩(wěn)定)，但對(duì)培養(yǎng)基的選擇仍存有爭(zhēng)論。第二，是選擇性增菌步驟，它使沙門氏菌生長(zhǎng)而使肉湯中同時(shí)存在的微生物數(shù)量減少，與預(yù)增菌培養(yǎng)基相似，對(duì)選擇性培養(yǎng)基的選擇，也存在許多不同的觀點(diǎn)。目前應(yīng)用的主要有如下3種類型：連四硫基鹽肉湯(Tetrathionate broth)、硒酸鹽胱氨酸肉湯(Selenite cystine broth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培養(yǎng)基。由于沒有任何一種培養(yǎng)基可以全面地保持所有食品基質(zhì)或各種沙門氏菌血清型，所以，較適當(dāng)?shù)淖龇ň褪鞘褂脙煞N培養(yǎng)基平行地進(jìn)行試驗(yàn)。第三步是分離步驟，即選擇性培養(yǎng)物在含一種或多種抑制非沙門氏菌生長(zhǎng)制劑的瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，然后對(duì)平板上肉眼可見的特征性菌落進(jìn)行確認(rèn)，并對(duì)該菌落分離物進(jìn)行一系列生化和血清學(xué)檢測(cè)，以作出鑒定。傳統(tǒng)沙門氏菌檢測(cè)法全過程需時(shí)至少4～7天，才能得出明確的診斷結(jié)果。
2 以抗體為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法
利用抗原-抗體反應(yīng)的顯著特異性，來(lái)進(jìn)行細(xì)菌的鑒別和血清學(xué)定型，已有半個(gè)多世紀(jì)的歷史。細(xì)菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來(lái)檢測(cè)以食品為載體的病原。已經(jīng)建立的沙門氏菌免疫學(xué)檢測(cè)方法有許多種，大致可分為以酶標(biāo)抗體(ELISA)，熒光抗體染色(免疫熒光法)，同位素標(biāo)記抗體(放射免疫試驗(yàn))為基礎(chǔ)的方法及其它多種以抗體為基礎(chǔ)，利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴(kuò)散及免疫色譜技術(shù)的方法。但常規(guī)中最廣泛采用的是以雙位點(diǎn)ELISA技術(shù)即夾心ELISA為基礎(chǔ)的方法。此法改進(jìn)后用有放射活性的同位素替代標(biāo)記抗體，概括地說(shuō)，是指以固定在固體基質(zhì)上的“捕捉”抗體來(lái)捕捉目標(biāo)抗原，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的成分，加入第二種酶標(biāo)抗體，此者結(jié)合在捕捉到的抗原的不同位點(diǎn)上，第二次洗滌后加入酶作用基質(zhì)，并令其與顏色成分反應(yīng)，然后用分光光度法即很容易檢測(cè)到目標(biāo)抗原。采用微量滴定板作為固態(tài)基質(zhì)使反應(yīng)形式標(biāo)準(zhǔn)化，并促成其自動(dòng)化。
最近黎兆滾等人首次在國(guó)內(nèi)口岸系統(tǒng)應(yīng)用微量板ELISA法(Salmonelle test 1)對(duì)進(jìn)出口動(dòng)物產(chǎn)品(魚粉、肉骨粉等)進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)。該法采用預(yù)先包被了沙門氏菌(A-E群)單克隆抗體的微量板，加入經(jīng)增菌處理的樣品，反應(yīng)后再加入一定的指示劑，作用畢后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值來(lái)判定結(jié)果。食物樣品經(jīng)適當(dāng)?shù)脑鼍幚�，也可用此法進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)。
ELISA法檢出沙門氏菌的極限范圍在105～106個(gè)細(xì)胞/ml，因此，要得出可靠的結(jié)果，食物樣品首先必需進(jìn)行預(yù)增菌、選擇性增菌，通常還要在含有D-甘露糖的肉湯(M肉湯)中進(jìn)行后增菌，以促進(jìn)鞭毛發(fā)育�？偟膩�(lái)說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品的制備，約需要經(jīng)過40～48h的孵育才能完成。黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)樣品制備過程分三步，共耗時(shí)24h：①選用營(yíng)養(yǎng)肉湯進(jìn)行預(yù)增菌(6h)，使“致傷”、冷凍的沙門氏菌復(fù)蘇。②使用選擇性培養(yǎng)基RV進(jìn)行增菌(14h)，使沙門氏菌大量繁殖，同時(shí)抑制其它雜菌生長(zhǎng)。③使用營(yíng)養(yǎng)肉湯(蛋白胨水)進(jìn)行后增菌(4h)，使沙門氏菌的數(shù)量大大增加。比上述標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品制備過程縮短了一半的時(shí)間。ELISA方法本身，則僅需要大約2h而已(其中30min是操作時(shí)間，90min是孵育時(shí)間)。相比之下，黎兆滾等人的方法可在27h內(nèi)完成，比上述方法縮短了一半的時(shí)間，頗值得推廣應(yīng)用。
最新式的沙門氏菌免疫學(xué)檢測(cè)法，利用經(jīng)特異性抗體敏化的免疫色譜卡片為基礎(chǔ)。幾滴樣品加到卡片上，結(jié)果可以直接用肉眼讀出。免疫色譜卡片極易操作，且由于無(wú)需要特殊設(shè)備，很適合小型實(shí)驗(yàn)室使用。盡管卡片檢測(cè)法與ELISA法一樣需要對(duì)樣品進(jìn)行增菌處理，但它(卡片法)本身通常需時(shí)不超過10min，如果采用黎兆滾等人的樣品制備法，則可使操作時(shí)間更為縮短。
3 以核酸為基礎(chǔ)的方法
細(xì)胞核酸DNA和RNA是唯一一類可以攜帶信息的大分子。由于所有的細(xì)胞都含有這種分子，可以利用它作為檢測(cè)的標(biāo)靶。標(biāo)靶通常是一個(gè)特異性核酸序列，它可通過以補(bǔ)體核酸分子作為探針來(lái)檢出。與免疫學(xué)方法相似，探針也需要加附適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，如放射性同位素、酶或發(fā)光的標(biāo)識(shí)物。Fitts等人在食品沙門氏菌檢測(cè)中引入了第一代DAN—RNA雜交技術(shù)，此法應(yīng)用的探針含有用放射性同位素標(biāo)記的傷寒沙門氏菌DNA片段，其敏感性高，經(jīng)大約48h的增菌步驟后，檢測(cè)極限可達(dá)108個(gè)細(xì)菌/ml，但由于要使用放射性同位素，只能在專門的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，此方法的優(yōu)點(diǎn)都被抵消了。為此，以核酸雜交為基礎(chǔ)的第二代技術(shù)—比色計(jì)目前已發(fā)展起來(lái)。這種方法依賴于沙門氏菌核糖體RNA(rRNA)—核糖體發(fā)育過程中儲(chǔ)存的核酸成分的檢測(cè)。核糖體是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成器的一部分，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中存在5000～20 000個(gè)復(fù)制體，而相比之下染色體DNA復(fù)制體僅2～10個(gè)。這種天然富含rRNA標(biāo)靶序列的情況使得用無(wú)輻射計(jì)檢測(cè)成為可能，同時(shí)又保持了與放射性同位素方法相當(dāng)或更高的敏感性。其另一優(yōu)點(diǎn)是由于rRNA為單鏈(而DNA為雙鏈)，雜交前無(wú)需經(jīng)過變性步驟。要得到陽(yáng)性結(jié)果，此法需要105個(gè)靶細(xì)胞/ml，因此對(duì)沙門氏菌檢測(cè)來(lái)說(shuō)，需要進(jìn)行預(yù)增菌和選擇性增菌，總共約50h。rRNA探針法比沙門氏菌ELISA法更耗時(shí)，但二者成本相近。
食品細(xì)菌檢測(cè)法的最新進(jìn)展是在化學(xué)擴(kuò)增體系方面的發(fā)展，即聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，用該體系可對(duì)制備好的樣品進(jìn)行細(xì)菌DNA擴(kuò)增，以便更易于用諸如凝膠電泳法或比色型ELISA法檢測(cè)。用于檢測(cè)沙門氏菌和其它以食物為載體的病原的PCR方法業(yè)已建立，其中一些方法顯示了極好的敏感性。但該法較難自動(dòng)化，且必需經(jīng)選擇性增菌以稀釋可能干擾檢測(cè)反應(yīng)的某些成分。一個(gè)完整的以PCR為基礎(chǔ)的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵銷了其高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，但這種方法對(duì)那些含沙門氏菌較少或沙門氏菌“致傷”嚴(yán)重難以復(fù)蘇而仍保有沙門氏菌rRNA的樣品尤其有效。
盡管目前用來(lái)檢測(cè)沙門氏菌的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但隨著科學(xué)發(fā)展，技術(shù)進(jìn)步，人們探索、實(shí)踐的繼續(xù)深入，我們可以期待，將會(huì)有更多，敏感性更高，特異性更強(qiáng)，診斷時(shí)間更短的新方法出現(xiàn)。
4 兩種沙門氏菌快速檢測(cè)法
4.1 Transia沙門氏菌平板檢測(cè)法 與耗時(shí)、昂貴的傳統(tǒng)方法相比，此法快1～2天，且每次檢測(cè)所需的操作時(shí)間縮短。該法建立在夾心ELISA法的基礎(chǔ)上，利用多抗體混合物以保證檢出所有的沙門氏菌血清型。反應(yīng)的固相載體是一種有可見或不可見條紋的微量反應(yīng)板。其小孔內(nèi)包被有沙門氏菌的特異性單克隆抗體。
第一階段，在小孔內(nèi)加入樣品和抗體聯(lián)合物(沙門氏菌屬特異性單克隆和多克隆抗體的混合物)。孵育期間，沙門氏菌抗原和包被抗體形成了一種復(fù)合物：包被單克隆抗體-沙門氏菌抗原-抗體聯(lián)合物。洗滌后，通過每孔加入基質(zhì)溶液(過氧化脲)和色素原溶液(四甲基氨基丙苯)來(lái)顯示上述復(fù)合物；酶催化色素原的氧化，結(jié)果產(chǎn)生藍(lán)色。加入反應(yīng)終止液終止催化反應(yīng)，并使反應(yīng)混合物酸化，顏色由藍(lán)變黃。
這種ELISA方法可對(duì)經(jīng)選擇性增菌及熱休克作用后，釋放了特異性沙門氏菌抗原的食品和環(huán)境樣品進(jìn)行檢測(cè)。如采用黎兆滾等人的樣品制備法，可大大縮短檢測(cè)時(shí)間；此法可在沒有酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，從這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，Transia沙門氏菌平板檢測(cè)法比黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)更適應(yīng)于一般的實(shí)驗(yàn)室使用。
4.2 Transia沙門氏菌卡片檢測(cè)法 此法以單步免疫反應(yīng)即夾心型免疫色譜反應(yīng)為基礎(chǔ)。反應(yīng)固相包括一塊用“抗沙門氏菌抗體-染料”偶合物浸透的染料襯墊和一張薄膜條，抗沙門氏菌抗體就固定在薄膜的反應(yīng)區(qū)上。增菌后，增菌肉湯用移液管加到樣品小孔內(nèi)并令其吸收，如樣品存在沙門氏菌抗原，它們會(huì)與偶合物作用，然后依次遷移到膜上，與固定在膜上反應(yīng)區(qū)的抗體結(jié)合，在反應(yīng)窗上呈現(xiàn)一條色帶。最后結(jié)果可在5～7min內(nèi)讀取。此法也適用于沒有酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)室。如采用黎兆滾等人的樣品制備法，可更加縮短檢測(cè)時(shí)間，可在普通實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行。