丙烯酰胺凝膠電泳

　　聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的電泳方法。在這種支持介質上可根據被分離物質分子大小和分子電荷多少來分離。

聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點：
①聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N'甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有 格子是帶有酰胺側鏈的碳-碳聚合物，沒有或很少帶有離子的側基，因而電滲作用比較小，不易和樣品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質，在聚合前可調節(jié)單體的濃度比，形成 不同程度交鏈結構，其空隙度可在一個較廣的范圍內變化，可以根據要分離物質分子 的大小，選擇合適的凝膠成分，使之既有適宜的空隙度，又有比較好的機械性質。一 般說來，含丙烯酰胺7-7.5%的凝膠，機械性能適用于分離分子量范圍不1萬至100萬物 質，1萬以下的蛋白質則采用含丙烯酰胺15-30%的凝膠，而分子量特別大的可采用含 丙烯酰胺4%的凝膠，大孔膠易碎，小孔膠則難從管中取出，因此當丙烯酰胺的濃度增 加時可以減少雙含丙烯酰胺，以改進凝膠的機械性能。
③在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對熱穩(wěn)定。凝膠無色透明，易觀察，可用檢測儀直接測定。
④丙烯酰胺是比較純的化合物，可以精制，減少污染。合成聚丙烯酰胺凝膠的原料是丙烯酰胺和甲撐雙丙烯酰胺。丙烯酰胺稱單體，甲撐雙 丙烯酰胺稱交聯(lián)劑，在水溶液中，單體和交聯(lián)劑通過自由基引發(fā)的聚合反應形成凝 膠。

　　在聚丙烯酰胺凝膠形成的反應過程中，需要有催化劑參加，催化劑包括引發(fā)劑和 另速劑兩部分。引發(fā)劑在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺 成為自由基，發(fā)動聚合反應，加速劑則可加快引發(fā)劑放自由基的速度。常用的引發(fā)劑 和加速劑的配伍如下表：

聚合反應催化劑配伍

　　注：(NH₄)₂S₂O₈，過硫酸胺 TEMED：N，N，N，N';四甲基乙二胺 DMAPN：β－二甲基胺基丙晴 　　用過硫酸銨引發(fā)的反應稱化學聚合反應；用核黃素引發(fā)，需要強光照射反應液， 稱光聚合反應。 聚丙烯酰胺聚合反應可受下列因素影響： 1、大氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應終止，所以在聚合過程中要使反應液與空氣 隔絕。 2、某些材料如有機玻璃，能抑制聚合反應。 3、某些化學藥物可以減慢反應速度，如赤血鹽。 4、溫度高聚合快，溫度低聚合慢。 以上幾點在制備凝膠時必須加以注意。 凝膠的篩孔，機械強度及透明度等很大程度上由凝膠的濃度和交聯(lián)決定。每100亳升 凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度，常用T%表達；凝膠溶液中交聯(lián)劑 占單體和交聯(lián)體總量的百分數(shù)稱為交聯(lián)度，常用C%表示，可用下式計算：

公 式

a：丙烯酰胺克數(shù)； b：甲撐雙丙烯酰胺克數(shù)；m：緩沖液體積（毫升） 凝膠濃度過高時，凝膠硬而脆，容易破碎；凝膠濃度太低時，凝膠稀軟，不易操作。

　　交聯(lián)度過高，膠不透明并缺乏彈性；交聯(lián)度過低，凝膠呈糊狀。 聚丙烯酰胺凝膠具有較高的粘度，它不防止對流減低擴散的能力，而且因為它具有三 度空間網狀結構，某分子通過這種網孔的能力將取決于凝膠孔隙和分離物質顆粒的大 小和形狀，這是凝膠的分子篩作用。由于這種分子篩作用，這里的凝膠并不僅是單純 的支持物，因此，在電泳過程中除了注意電泳的基本原理以外，還必須注意與凝膠本 身有關的各種性質（網孔的大小和形狀等）。可通過下式計算來選擇適當?shù)哪�膠網 孔。

公 式

　　式中：P為網孔平均直徑，C為多聚體濃度，d為該多聚體分子直徑（若不是卷曲的分 子應為5A），K為常數(shù)，K值取決于漲膠的幾何構型，假如多聚體的鏈是以近似于直角 交聯(lián)的，則約為1.5根據此式，我們可以通過多聚體濃度C近似地計算出網孔直徑，例 如已知多聚體濃度為5%，其網孔平均直徑應為：

公 式

　　這樣的計算是粗略的，與實際情況有一定距離，有人測定了總濃度（T）為20%的丙烯酰胺液，在六種不同比例的雙丙烯酰胺存在 下，聚合后的網孔大小，發(fā)現(xiàn)孔徑與總濃度有關，總濃度愈大，孔徑相應變小，機械 強度增強，與總濃度不變時，甲叉雙丙烯酰胺（Bis)的濃度在5%時孔徑最小，高于或 低于此值時，聚合體孔徑都相對變大，凝膠孔徑在凝膠電泳中是一個重要的參數(shù)，它 往往決定了電泳的分離效果。經過不斷的實踐，得到了如表3所示的經驗值，在一般情況下，大多數(shù)生物體內的蛋白質采用7.5%濃 度的凝膠，所得電泳結果往往是滿意的，因此稱由此濃度組成的凝膠為“標準凝 膠”。

對那些用于重要研究的凝膠，最好是通過采用10%的一系列凝膠濃度梯進行預先試驗，以選出最適凝膠濃度。

表3不同分子量范圍的蛋白質和核酸在凝膠電泳 中所選用的凝膠濃度百分率

　　聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類，前者指整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖 液，pH值和凝膠網孔都是相同的，后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩 沖液，pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨 能力。

　　蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小 和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大 小，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。1967年，Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑 十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用。當向蛋白質溶液中加入足夠量SDS和巰基乙 醇，SDS可使蛋白質分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白 質—SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別，SDS與蛋白質結合后，還可引起構象改 變，蛋白質—SDS復合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物 的短軸長度都不一樣，約為18A，這樣的蛋白質—SDS復合物，在凝膠中的遷移率，不 再受蛋白質原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質的分子量。