如今,質(zhì)粒載體中限制酶切位點(diǎn)的種類(lèi)極為繁多,因而通常都有可能找到某種帶限制酶切位點(diǎn)恰恰與外源DNA片段本身毫無(wú)二致的載體。這就具備一個(gè)不可比擬的優(yōu)點(diǎn),也應(yīng)是可以用相應(yīng)的限制酶消化重組質(zhì)粒崦回收外源DNA。另一種方案,則是把片段插入到載體中能產(chǎn)生匹配末端的任何位點(diǎn)中。例如,識(shí)別不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ產(chǎn)生具有相同突出末端的限制酶切片段,這樣用BglⅡ消化而制備的外源DNA片段可以克隆到用BanHl消化的質(zhì)粒中。這通常會(huì)使接合序列不能被曾用于外源DNA或制備載體的任何一種酶所切開(kāi)。然而很多清況下,用切點(diǎn)位于多克隆序列側(cè)翼的限制酶進(jìn)行消化,可將片段從重組質(zhì)粒中摘出。偶爾在質(zhì)粒的以及外源DNA兩端的限制酶切位點(diǎn)之間,不可能找到“門(mén)當(dāng)戶(hù)對(duì)”的搭配關(guān)系。這時(shí)可用下面兩種方案加以解決:
1)在線(xiàn)狀質(zhì)粒末端和(或)外源DNA片段的末端接上合成在接頭或銜接頭。
2)在得到控制的反應(yīng)條件下,用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段部分補(bǔ)平帶3'凹端的DNA片段。如第九章所討論,這樣常可以使那些不相匹配的限制酶切位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端,從而促進(jìn)載體和外源DNA的連接。因?yàn)椴糠盅a(bǔ)平反應(yīng)消除了同一分子兩端彼此配對(duì)的能力,故連接反應(yīng)過(guò)程中環(huán)化和自身寡聚化的機(jī)會(huì)也會(huì)有所降低(Hung和Wensink,1984;Zabarovsky和Allikmets,1986)。