用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段標(biāo)記合成的寡核苷酸

　　在某些情況（例如用寡核苷酸作Southern印跡雜交的探針）下，重要的是要將寡核苷酸標(biāo)記至盡可能高的放射性比活度。磷酸化反應(yīng)最多能使每一寡核苷酸分子中摻入一個(gè)32P原子。但用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段3合成與合成寡核苷酸互補(bǔ)的DNA鏈， 則可得到比活度更高探針（Studencki 和Wallace，1984;Ullrich等，1984b）。用一短引物與寡核苷酸模板結(jié)合，后者的序列互補(bǔ)于所用的放射性標(biāo)記探針。 該引物后在大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段的作用下延伸，從而使[γ－³²P]dNTP在模板指導(dǎo)下發(fā)生摻入。反應(yīng)后，通過(guò)對(duì)模板和產(chǎn)物進(jìn)行變性繼而通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳交將它們分開(kāi)。用這種方法，有可能生成這樣一種寡核苷酸探針，即每一寡核苷酸分子帶有若干個(gè)放射性原子。其放射性比活度可高達(dá)2x10¹⁰計(jì)數(shù)/（分．mg）。對(duì)該法進(jìn)行改進(jìn)后，可以由兩段3'端含互補(bǔ)序列的寡核苷酸合成更長(zhǎng)的探針（Ullrich等，1984a）。
在準(zhǔn)備進(jìn)行這些類(lèi)型的反應(yīng)時(shí)，務(wù)必考慮以下幾點(diǎn)：

（1）反應(yīng)中[α-32P]dNTP的比活度 α－磷酸已完全被³² P置換的一個(gè)dNTP分子的比活度大約為9000Ci/mmol。比活度更低的制品所含的是³² P標(biāo)記的和未標(biāo)記的分子混合物。這樣，假如用比活度為3000Ci/mmol的單種d NTP參與合成反應(yīng)，同時(shí)該種核苷酸在混合物中的可摻入位置又只有3個(gè)，那么每個(gè)探針?lè)肿討?yīng)將平均只帶上一個(gè)³²P 原了（即其比活度將約等于用T4噬菌體多核苷酸激酶標(biāo)記的探針）。如果知道目標(biāo)探針的序列和得前體的比活度，應(yīng)有可能預(yù)計(jì)當(dāng)1種、2種、3種和全部4種dNTP摻入反就時(shí)所得的探針的比活度。

（2）反應(yīng)中dNTP的濃度 反慶中每種d NTP的濃度應(yīng)不低于1μmol/L，否則核苷酸的聚合就無(wú)法有效地進(jìn)行。所以。至關(guān)重要的是要確保在反應(yīng)進(jìn)行的過(guò)程中底物濃度不降至1μmol/L（約0.66ng/μl）以下， 應(yīng)根據(jù)板應(yīng)中所有的單鏈序列全部作用模板這一假設(shè)來(lái)計(jì)算可摻入探針的每種dNTP的總量。 反應(yīng)中每種dNTP的總量應(yīng)為可摻入探針的量加上0.66ng/μl所得的和。

（3）引物的長(zhǎng)度和特異性 引物必須有足夠的長(zhǎng)度的特異性，以便能與模板結(jié)合并在適當(dāng)位置上啟動(dòng)合成。用于本用途的引物通長(zhǎng)7－9個(gè)核苷酸，并與模板寡核苷酸3'端或緊鄰3'端的序列互補(bǔ)。由于難以預(yù)測(cè)中短雜交體的穩(wěn)定性，故應(yīng)有著手大規(guī)模反應(yīng)之前，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定引物與模板間的比例應(yīng)為多少才能使探針的產(chǎn)量最大。

（4）終產(chǎn)物的長(zhǎng)度 終產(chǎn)物是與模板等長(zhǎng)或比模板稍短（這主要取決于與引物互補(bǔ)的序列在模板上的位置）的雙錠DNA片段，為了盡可能得到最有效的探針，必須將非標(biāo)記模板鏈從放射性標(biāo)記的互補(bǔ)產(chǎn)物中有效地分離出去，否則兩長(zhǎng)互補(bǔ)鏈將互相退火，從而遏制與所需要的靶序列的雜交。對(duì)于短于30 個(gè)核苷酸， 進(jìn)行19％聚丙稀酰胺凝膠電泳是分離互補(bǔ)鏈的最為有效的方法。如果兩長(zhǎng)鏈長(zhǎng)度再稍有不同。則分離效率不可以更高，所以，應(yīng)當(dāng)說(shuō)可能將引物設(shè)計(jì)成與模板上毗今最末端的核苷酸互補(bǔ)。假如引物與模板3'端2－3個(gè)核苷酸不能雜交， 那么放射性標(biāo)記引物應(yīng)會(huì)比非標(biāo)記的模板短一些，通過(guò)電泳進(jìn)行分離的效率也就更高。不過(guò)，即使模板與產(chǎn)物的長(zhǎng)度相同，兩者在電泳過(guò)程中仍然極的可能得到一定程度的分離。因?yàn)閱捂満怂嵩谀�膠中的遷移率不僅取決于鏈長(zhǎng)，而且也取地堿基組成和序列。在合成探會(huì)之前用無(wú)放射性的ATP將兩針鏈之一（模板或引物）磷酸化 ， 或者通過(guò)保留連在引物5' 端的二甲氧三苯甲基（Studencki和Wallace，1984），通常還可以提高分離程度。 由于我們不呆能預(yù)料究竟何種方法對(duì)于某一特定的寡核苷酸最為有效，因此通常有必要進(jìn)行一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定在各種情況下產(chǎn)物與模板分離的效率。

1）在微量離心管中將[α－³²P]ATP混勻， 依據(jù)能使比活度達(dá)到要求和足以在所有模板鏈上進(jìn)行全長(zhǎng)合成的需要來(lái)計(jì)算[α－³²P]ATP的量。切記dNTP深度在反應(yīng)的任何階段都不得于1μmol/L。為保證諸試劑的濃度足夠高，應(yīng)以盡可能小的體積進(jìn)行反應(yīng)。 所以最好使用保存于醇－水溶液中供應(yīng)的放射性標(biāo)記dNTP作底物， 而不用以水性緩沖液為供應(yīng)者。適當(dāng)體積的[α－³²P] ATP的乙醇溶液既可在作反應(yīng)用的離心管中進(jìn)行混合。，又能在管中蒸發(fā)至干。

2）向離心管內(nèi)加入適量的引物和模板DNA。為保證引物能夠有效地引導(dǎo)反應(yīng)，其摩爾數(shù)應(yīng)過(guò)量，達(dá)到模板的3-10倍。

3）加0.1體積的10xKlenow緩沖液。充分混勻。
10xKlenow緩沖液
0.4mol/L磷酸鉀（pH7.5）
66mmol/L MgCl2
10mmol/L β－巰基乙醇

4）按每5反應(yīng)體積2－4單位加入大腸桿菌DNA聚合酶IKoenow片段。充分混勻。

5）用等體積的凝膠加樣緩沖液將反應(yīng)稀釋?zhuān)�并�?0℃加熱3分鐘，隨后將全部的反應(yīng)液加樣至變性聚丙烯酰胺凝膠（即加7mol尿灌制者）。
凝膠加樣緩沖液
80％（W/V） 甲酰胺
590mmol/L Tris-硼酸（pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
0.1％(W/V)溴酚藍(lán)
甲酰胺：許多批號(hào)的試劑級(jí)甲酰胺，其純度符合使用要求，無(wú)須再進(jìn)行處理。不過(guò)，一旦略呈黃色，則應(yīng)在磁力攪拌器上將甲酰胺與Dowex XG8混合床樹(shù)脂共同攪拌1小時(shí)進(jìn)行去離子處理；并用Whatman1號(hào)濾紙過(guò)濾2次。去離子甲酰胺分裝成小體積，充氮存于－70℃。按照反應(yīng)混合液中寡核苷酸大小的不同，用于制膠的聚丙烯酰胺的濃度和電泳條件也不相同。下表列出一些在常用的提示

聚丙烯酰胺凝膠通常用1xTBE（89mmolk/L Tris-硼酸、2mmol/L EDTA）灌制，電泳亦在相同緩沖液中進(jìn)行。
6）電泳結(jié)束后，卸下電泳裝置，將其中一面玻璃板與凝膠分開(kāi)。小心：未摻入的[α－32P]ATP可能已遷移至下槽緩沖液中而使之具有放射性！ 將凝膠及其背面的玻璃板裹于Saran包裝膜內(nèi)。記下示蹤染料的位置，用手提式小型探測(cè)器在凝膠上應(yīng)含有寡核苷酸的部位檢測(cè)放射性活度值。將一組涂有放射性墨水的粘性圓點(diǎn)標(biāo)簽紙圍繞品的同邊粘貼在Saran包裝膜上，用Scotch膠帶將圓點(diǎn)標(biāo)簽紙覆蓋，以防放射性墨水法染X光片夾或增感屏。交凝膠對(duì)放射自顯影底片進(jìn)行曝光，摻入探針的放射性相當(dāng)高，數(shù)分鐘仙即可在膠片上得到影像。利用上述方法中圓點(diǎn)標(biāo)簽上的放射性標(biāo)記定出凝膠中探針的位置。切下條帶，方法回收放射性標(biāo)記寡核苷酸。放射性墨水系上少量32P與防水的黑色繪圖墨水混合而成。為方便起見(jiàn)，我們將這種墨水分為3級(jí)：極熱級(jí)（>2000計(jì)數(shù)/秒，據(jù)手提式小型探器）、熱級(jí)（500-2000計(jì)數(shù)/秒，據(jù)手提式小型探測(cè)器）和冷級(jí)（50-500計(jì)數(shù)/秒， 據(jù)手提式小型探測(cè)器）。用一纖維尖筆將所要求等級(jí)的墨水涂在粘性標(biāo)簽紙上。應(yīng)在該纖維尖筆上貼上放射性物質(zhì)的專(zhuān)用提示膠帶，妥善保管。