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我的試驗咋û出結(jié)果呢？
明明……為什ô會是這樣？
……
作為實驗室的科研狗
那些絕望的咆哮
現(xiàn)在有û有在耳邊響起……
其實，仔細查找原因，
往往是由于操作上面的不認真，
或一些忽略的小細節(jié)
小編收集了各·實驗小白到大神的實戰(zhàn)經(jīng)驗血淚史
和大家分享：
1.跑page膠的時候
小電壓跑會避免高電壓產(chǎn)生的熱量爾導(dǎo)致的膠層變形。低電壓泳道會比大電壓泳道跑的直一些，且分離效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分離。
2.提取質(zhì)粒的時候
最后一步的酒精揮發(fā)很關(guān)鍵，基本上是其后續(xù)的ø切反應(yīng)的決定性因素。所以這一步盡量揮發(fā)長一點時間，最好是空調(diào)吹熱風，或是37度溫箱放長一點的時間，我試過室溫過夜，ø切很好。
3.做WESTERN BLOT 的時候
大家往往會摸索一抗、二抗的濃度，封閉時間，曝光時間等等，而ÿ次變換其中的一個條件就需要從新跑膠、轉(zhuǎn)膜，甚至重新提蛋白，這樣會浪費大量的時間。其實完全û有必要這樣。一次轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜晾干，裁減成小塊，保存起來，用的時候取出一塊，û有任何影響。這對于摸索條件的戰(zhàn)友來說，節(jié)約了大量的時間。
4.有關(guān)緩沖液和培養(yǎng)基配置
1)將緩沖液配方中的成分分別以10-100倍配成母液儲存，需要的時候只需將相應(yīng)的母液混合，補加水稀釋即可。
2)配培養(yǎng)基時通常會忘記各成分的量，如配LB時的三個成分不記得到底哪個是5g，哪個要10個，因此可以在常用的試劑瓶的標簽上注明所需的量，如配LB時，在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等，很方便，不需要ÿ次配之前臨時翻書。
5.有關(guān)PCR主反應(yīng)液配置
在做克¡鑒定的時候經(jīng)常需要在ø切鑒定前進行PCR鑒定，ÿ次配置PCR反應(yīng)液很繁瑣，可以將其配置類似kit的形式，按你需要的反應(yīng)體系列表，然后放大100倍配置100×主反應(yīng)液(100次反應(yīng))，其中含buffer，Mg2+，dNTPs，但不含引物和Taqø，然后可以10×分裝或一管儲存在-20度，在需要的時候拿出融開，然后按所需的PCR反應(yīng)個數(shù)吸取相應(yīng)的倍數(shù)，再補加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的Taq和引物，混勻后分裝，這樣做的好處如下：
1)可極大的節(jié)省寶貴的時間，可早點收工，看球；
2)避免ÿ次反應(yīng)加樣不均的可能；
3)大大減少PCR假陽性的產(chǎn)生。
6.有關(guān)ø切反應(yīng)液的配置
在做ø切時，也可以象PCR一樣配置主反應(yīng)液，ÿ次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系，算好需要的反應(yīng)數(shù)，然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大，加入buffer、ø、水，質(zhì)粒欄空缺，然后混合后按除質(zhì)粒DNA的體積分裝，然后再在ÿ管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒DNAø切，這樣做的好處如下，特別是當同時有10幾個陽性克¡需要鑒定時尤為明顯：
1)各反應(yīng)成分均一；
2)可大大減少限制型內(nèi)切ø的使用；
3)節(jié)省時間。
7.有關(guān)SDS－PAGE：
1)可將SDS-PAGE的積層膠，分離膠預(yù)先配好大體積如100ml儲存在4度冰箱(注：10%AP，TEMED不加，切記!!!)，ÿ次配置時只需吸取相應(yīng)體積的預(yù)制膠加入AP，TEMED即可，û必要ÿ次制膠時候翻分子克¡，特別方便，而且，這樣的預(yù)制膠可儲存半年以上，不失為偷懶的絕佳方法;更關(guān)鍵的是可大大減少與丙稀酰胺的接觸，因此大大減少中毒的機會。
2)電泳時雖然小電泳分離效果要好一些，但2小時以上的等待的時間實在是痛苦，因此可以提高電泳至150V，但需要將整個電泳槽放在放滿冰水的臉盆里散熱，這樣跑出來的膠分離效果絲毫不比低電壓來的差，關(guān)鍵是時間大大節(jié)省，不需1h即可看結(jié)果了。
8.實驗中小竅門
能夠分成兩類：一類是“非常規(guī)”操作;一類是常規(guī)操作過程中一些省時省事手段。
前一類，舉個例子：有時候第一天涂的轉(zhuǎn)化平板、次日早晨轉(zhuǎn)化子可能長成的菌落比較大(1~2毫米以上，BL21就長得快)，下一步轉(zhuǎn)化子做質(zhì)粒鑒定。這個情況下可以直接挑取一塊菌苔(勿帶出培養(yǎng)基)，50微升酚/氯仿懸浮菌體，放置兩分鐘，加40微升TE抽提，上層TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上層TE即是質(zhì)粒提取液。提取的質(zhì)�？梢灾苯佑糜陔娪竞�ø切。這樣操作，可以省去轉(zhuǎn)接液體試管的培養(yǎng)步驟，至少節(jié)省6~8小時的時間。但是，要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和ø切的效果，不同的實驗室或者操作者δ必能夠很方便地重復(fù)----其實，其它的一些“小竅門”也是如此。
后一類的小竅門則在實驗室中無處不在。
如：平行作不同樣本的PCR,模板DNA加量一樣，配置PCR體系可以一起配制后分裝----這點做過試驗的都知道，但是配制的時候配制量可以比預(yù)期分裝量稍多一點(如用100微升則配110微升)，這樣可以避免有時候分裝不夠的尷尬，因為不同特別是大小不同的槍，會有誤差。再比如：sds-page膠預(yù)配(APS和TEMED、或者后者先不加)的問題，實際上時間放置過長肯定影響效果，如果要在一天內(nèi)連續(xù)地跑兩次板，何嘗不可?又比如，配sds-page膠的時候，上層膠和下層膠可以只用一個大槍頭：先取膠，次取水，取6.8的tris后再取8.8的tris，省時省料。
但我想，“竅門”和“偷懶”不應(yīng)該是因果關(guān)系。其實，不管是那一類的小竅門，都是在充分地理解實驗各步驟的原理、經(jīng)過多次試驗積累、再加上一點點思索然后嘗試的結(jié)果。知其然知其所以然和勤于思考敢于探索，是根本。否則，別人的小竅門對你也δ必能夠有用。才進實驗室的新手，務(wù)必要先練好規(guī)范扎實的操作，然后才能弄“竅門”。本末倒置，貽害無窮。
9.SDS －PAGE的積層膠
分離膠預(yù)先配成mixture，APS制膠時加入，半年內(nèi)使用，絕對û有問題，我保證。
10.做SDS-PAGE的時候
除了蛋白量上樣一致，最好體積也一致，這樣跑出來的膠各個泳道之間的band能做到一樣寬，方便后面的比較，特別是WB。做法就是拿1X的上樣緩沖補全要加的樣做到體積一致，否則跑出來會有的寬有的窄，特別是上樣體積相差較大的。
11.在把蛋白膠做成干膠時
很多時候會因為有氣泡使膠裂掉，我的經(jīng)驗是在做膠時加上層膜前在膠上多加些水就不容易進氣泡了，還有就是高溫烘膠，我喜歡放到60度烘箱里烘，這樣水分蒸發(fā)速度快，即使有一些小的氣泡也不會有影響，呵呵，這是經(jīng)驗之談，我從來都û失手過，大家可以試試。
12.做大腸表達時
確定蛋白是否表達一般要煮樣做誘前誘后檢測,但很多時候煮出來的很黏影響跑膠效果.我發(fā)現(xiàn)如果現(xiàn)用8M Urea重懸細菌再煮效果會有極大改善。
注:不能用Gu-HCl代替。
13.我也推薦幾個偷懶的方法
1. 做SDS-PAGE跑膠通常都是現(xiàn)配現(xiàn)用,但配膠要>1h,所以如果想第二天睡個懶覺而又不耽誤跑膠可以于前一天晚上做好濃縮膠和分離膠,待凝聚后不要拔下梳子,把含膠玻璃板從制膠槽取下,用保鮮膜包上,注意玻璃板上下兩邊緣會有氣體,所以需要加一點電泳緩沖液以避免膠內(nèi)水分蒸發(fā).然后放4度過夜.第二天直接拔下梳子行后續(xù).國外好多公司出售腳既是如此,可以保存上星期。
2. 配置分離膠或者非變性膠時因膠凝時收縮可導(dǎo)致加樣孔變淺.可以將加剩的膠放入4度以降低凝聚速度,而將凝膠放入37度促聚,并隨時用4度加剩的膠補充下降的膠面.另外將膠橫放與水平面成~10度角也可以減少收縮的影響。
3.推薦一個節(jié)約抗體/時間的做法:
同時跑2塊膠,同時轉(zhuǎn)膜,然后兩塊膜背靠背放入同一封口膜同時封閉,同時一抗二抗(最好是用轉(zhuǎn)輪,這樣效果好.如果是搖床,隔一段時間幫它們翻個身以保證兩張膜的正面都有機會與液體充分接觸.一起洗膜(可以稍微加強洗膜也可以不做.我最多一張盤子里放4張膜而û有影響洗膜).可分別或同時壓片.這樣就可以節(jié)約一半抗體和接近一半時間而不會影響結(jié)果。
或者另外一個就是孵育后的抗體不要扔,好的抗體可以反復(fù)做好幾張膜呢.但ÿ次都會減弱,效果不如上面一種方法。
14.做western blotting 轉(zhuǎn)膜時
膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝 好轉(zhuǎn)膜裝置，我的經(jīng)驗是把膜印在膠上直接在膜上畫出預(yù)染maker條帶，方便的很。因為很多時候跑電泳時膠上的預(yù)染maker很清楚，等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了。不過要注意畫好預(yù)染maker后就不要使膠和膜發(fā)生對λ移動了，以防m(xù)aker失去參照價值。
15.超濾最合適用于蛋白的濃縮
更換緩沖液和除鹽，對于按照分子量進行初分離的效果不是很好，理論和現(xiàn)實是有很大差別的。
16.關(guān)于Western Blot
1)器具的清潔非常重要，開始做前，為了安全，尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來水反復(fù)沖洗，確保無洗滌殘液后用蒸餾水沖洗2-3遍，然后用去離子水沖洗一遍。最后用95%酒精再擦一遍后晾干備用。
2)配膠最好現(xiàn)用現(xiàn)配，先配下層膠(分離膠)，后配上層膠(濃縮膠或積層膠)，而且在臨灌膠前加APS并迅速混勻，即用移液槍抽吸與注入1-2次即可。
17.跑蛋白page的時候
一開始用加樣針，太麻煩，發(fā)現(xiàn)用20ul槍+普通小白槍頭點，非常省事。另外，點樣時有可能看不清孔在哪，看遠離你的那面膠，孔有反光的。點樣也點你對面的那塊膠，省的總低頭，干咱這行的容易得頸椎呀，愛惜自己。
18.垂直電泳時
可在電泳糟中放入青ù素小瓶等，可自然使液面提高而不影響電泳，又很節(jié)約電泳緩沖液。
19.我們有時要沉淀東西時
由于沉淀量很少，離心完之后不知道到底有û沉淀下來東西，由于量很少，不好觀察，所以離心時建議按特定的方向放置離心管，這樣你就可以在離心之前確定沉淀該沉淀到管子的大致部λ，這樣離心后就可直接觀察那有û有沉淀，避免滿管子找，另外看沉淀時可以對光看，這樣就是顆粒狀的細小沉淀也能看見的。
20.大家都知道PMSF有劇毒
以前都是知道濃度和要配的體積的基礎(chǔ)上,算出要稱多少毫克的PMSF,其實也可以先稱PMSF,稱多少算多少,再調(diào)整異丙醇的體積，到達你所要的濃度。這樣就避免了你長時間和它接觸。
21.跑好SDS-PAGE膠的一些體會：
1. 清洗好玻璃板，不要偷懶，很多時候跑完電泳撬膠時會因為玻璃板不干凈膠粘在板上把膠撬破。
2. 配膠時不要反復(fù)用槍混，稍微搖混就可以了，用槍混多次會導(dǎo)致膠凝不好影響電泳圖的分辨率。
3. AP分裝成500微升一管保存放-20度，避免AP用太久失效。
4. 倒膠時把玻璃板中的水用濾紙盡量吸干，因為微量的水存在會影響配的膠濃度。
5. 盡量不用過夜放室溫或者四度的膠，也回影響膠 的分離效果。
6. 電泳完撬膠時根本不需要用撬膠板，在一平皿里裝好水，把有膠一面的放在水中晃動幾次膠很容易就脫落下來，一點û有問題，方便的很。
7. 點樣時樣品別忘了離心這步，因為上樣含有固體沉淀會影響電泳圖分辨效果。
8. 盡量在冰浴狀態(tài)下跑。
22.關(guān)于２－ＤＥ
總結(jié)了幾個小竅門：
1.一向電泳時，鹽離子容易聚在 膠槽的兩側(cè).剪一小段IPG膠條放在兩側(cè)，構(gòu)成鹽橋，電壓就容易上去了。避免一向電泳不好影響最后實驗結(jié)果。
2. SDS-PAGE時,在灌膠之前,一般大家都會用凡士林封底, 在SDS-PAGE電泳之前又必須把凡士林搽干凈,很是麻煩,我的經(jīng)驗是:不用凡士林,取少量δ加Ap的分離膠,按比例加2倍量的Ap,然后灌入板間,等上幾分鐘,待膠凝固后就可以接著灌分離膠方面,效果好!
23.蛋白質(zhì)純化時
蛋白質(zhì)降解可能與超聲破菌保持冰浴有關(guān)，之前建議加pmsf，建議在上柱子洗脫的時候也加pmsf(蛋白降解抑制劑)，一定要用之前再加。
24.做透析的時候
拿一個5ml的槍頭或者是其他類似的東西，剪短，穿過個塑料泡沫之類的面積比燒杯大東西，然后把透析帶一端扎緊，另一端開口綁緊在5ml槍頭下端，扎緊得那端也可以彎過來綁成u字型。這樣就可以用1ml的槍穿過5ml的槍頭的孔，另一只手調(diào)整透析帶，來加樣取樣，省去了總綁透析帶的麻煩，對同一個蛋白大量多次透析非常方便
25.自己的實驗技巧：
1. 配SDS-PAGE膠時，用槍頭混勻比較麻煩，而且費時費力，效果也不好。可以剪一小段夾文件的那種曲針做轉(zhuǎn)子放到配膠的小燒杯里，在磁力攪拌器上邊攪邊加入各溶液，這樣加完也就混勻了，直接灌膠即可。
2. 上面的站友也說過，上樣用黃槍頭就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建議大家也試試。
3.電泳后考馬斯亮藍染色一般要1h到2h，脫色也要2h左右，麻煩的很。現(xiàn)在給大家說一個簡單的方法，是我從一個師姐那里學到的。加入染色液后，先放入微波¯里加熱5-10秒，使染色液微熱即可(千萬不要加熱太久，否則冰醋酸就揮發(fā)了)。然后放水平搖床上搖20分鐘，最多半小時就染好了。
脫色也很簡單，不用脫色液，直接用去離子水，放微波¯里煮沸5分鐘左右，然后將水倒掉，再換上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次，就可以了。效果可能比正常的脫色稍差一點點，不如那樣清楚，只要電泳時比平時多上1/5的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時省材料(用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液)。
來源：網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)載，封面圖來源圖怪獸，食品微生物檢測小編整理。
