凋亡細胞的原位末斷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL法)
 

細胞凋亡的多步驟機制作用的最終環(huán)節(jié)是;細胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致核染色質(zhì)DNA雙鏈的斷裂。大量DNA片段暴露出的3羥基在末斷轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)或DNA多聚酶的作用下，與生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸結(jié)合，最終借助與卵白素或抗地高辛抗體結(jié)合的熒光素或HRP，使凋亡細胞被特異性地標(biāo)記和顯示出來。
 

TUNEL細胞凋亡試劑盒由美國羅氏公司提供

試劑1：酶濃縮溶液(EnzymeSolution)

試劑2：標(biāo)記溶液(LableSolution)

試劑3：轉(zhuǎn)化劑-POD(Converter-POD)

酶標(biāo)記抗熒光素抗體(即用型)
 

試驗所需其它試劑：
 

非石蠟切片:

·沖洗緩沖液:磷酸鹽緩沖液(PBS)

·阻斷溶液:0.3%H2O2甲醇溶液

·固定溶液:4%多聚甲醛(溶劑pH7.4新鮮配制的PBS溶液)

·滲透液:0.1%Triton甔-100(溶于新鮮配制的0.1%枸櫞酸鈉溶液)
 

石蠟切片:

·二甲苯和乙醇(100%、95%、90%、80%、70%用蒸餾水稀釋)

·沖洗緩沖液:磷酸鹽緩沖液(PBS)

·蛋白酶K工作液10~20mg/ml溶于10mMTris/HCl(pH7.4~7.8)
 

根據(jù)需要選擇:

·滲透液:0.1%TritonX-100(溶于新鮮配制的0.1%枸櫞酸鈉溶液)

·胃酶溶液(0.25%-0.5%溶于HCl，pH2)或胰酶

·0.1M枸櫞酸緩沖液，pH6，微波修復(fù)
 

材料：微波爐，微波輸出功率850W-2000W2.選用中性甲醇固定的活檢及實驗動物標(biāo)本，常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。

抗原微波修復(fù)(供參考)

1.組織經(jīng)福爾馬林固定后會產(chǎn)生廣泛的蛋白質(zhì)交連，因此石蠟組織進行凋亡檢測時要進行預(yù)處理。經(jīng)我公司科研人員的長期研究認為：TUNEL染色時蛋白酶K的作用有可能引起內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的釋放，造成假陽性反應(yīng)，同時過量的蛋白酶K處理可破壞組織的結(jié)構(gòu)，用微波技術(shù)替代上述處理可避免上述弊端的出現(xiàn)。

2.微波已被愈來愈多地作為免疫組織化學(xué)和原位雜交的預(yù)處理過程，經(jīng)一定溫度的微波處理可修復(fù)因固定和包埋造成的抗原破壞，打斷氨基酸的肽鍵結(jié)合，促進抗原決定簇的暴露，恢復(fù)細胞膜的空間結(jié)構(gòu)，增加穿透效應(yīng)，加速組織處理及染色過程。我們在作TUNEL染色前進行微波修復(fù)，可以達到蛋白酶K的功效，取得較為理想的效果，背景染色很淺，凋亡細胞陽性顆粒與背景染色對比非常鮮明。

3.蛋白酶K作用的條件嚴格，消化度常因組織的不同而在操作中不便掌握。同時蛋白酶K的價格昂貴，而微波已作為一種常用儀器用于免疫組織化學(xué)染色中。

(1)切片常規(guī)脫蠟入水

(2)將一燒杯盛200ml的0.01M、pH6.0的檸檬酸緩沖液，加熱至90～95℃，迅速放入切片，使用680W(80%功率)、微波照射1min，加入雙蒸水(20～25℃)80ml作迅速冷卻，將玻片移至PBS(20～25℃)。(3)PBS洗5min×3次。

(4)加20%正常牛血清室溫30min。

(5)將TUNEL反應(yīng)混合液加在切片上，37℃溫育90min(陰性對照片、TUNEL混合液中不加TDT)。

(6)PBS洗5min×3次。

(7)3%H2O2甲醇液室溫阻斷10min。

(8)37℃溫育90min。

(9)加POD轉(zhuǎn)化劑，37℃溫育30min。

(10)PBS洗5min×3次。

(11)DAB/H2O2顯色。

(12)蘇木素淡染，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封固。

結(jié)果：細胞核呈棕色顆粒者為陽性細胞，結(jié)合形態(tài)特征，可確立凋亡細胞。陰性對照片無棕色顆粒。
 

細胞凋亡的檢測技術(shù)簡介(供參考)

一.凋亡細胞的形態(tài)學(xué)改變

細胞表面：偽足,微絨毛等消失

細胞體形態(tài)：細胞皺縮，變形，體積變小

細胞核：染色質(zhì)濃縮，早期染色質(zhì)聚集于核膜邊呈新月形或環(huán)形，晚期碎裂

細胞器：密集但形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整，早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短暫擴張細胞膜:完好，晚期包裹細胞器或核碎片，形成凋亡小體

在組織中表現(xiàn)：常常以單個細胞散在

發(fā)生周圍組織反應(yīng)：凋亡細胞或小體被鄰近巨噬細胞，上皮細胞吞噬，降解，不發(fā)生炎癥反應(yīng)

發(fā)生條件：屬于基因控制的程序性細胞死亡，多發(fā)生于器官萎縮，細胞介導(dǎo)的免疫殺傷機制，小劑量毒素作用以及多種病理生理狀態(tài)
 

二.細胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測方法

(一)凋亡細胞的光鏡和熒光顯微鏡檢測

1.制片

(1)常規(guī)組織學(xué)切片，進行脫蠟和水化。

(2)培養(yǎng)細胞可用細胞離心儀制片。由于凋亡細胞在制片中容易破碎,所以應(yīng)采用低速離心制片(250g,離心5min)，并事先將載玻片用1%BSA處理，使細胞易于貼附.離心后涂片,稍經(jīng)空氣中干燥后，迅速用1%多聚甲醛4℃下固定15-30min，然后轉(zhuǎn)入80%乙醇后固定1-2h，保存于-20℃待用.

2.染色方法

可用多種方法進行染色。

(1)可采用常規(guī)的組織學(xué)染色方法，如Giemsa染色，HE染色或Mayer蘇木素染色.

(2)采用熒光染料染色，如DAPI(4′,6′-diamidino-2-phenylindole),PI(propidiumiodide)和7-AAD(7-aminoacetinomycinD).其染色濃度為:DAPI1-2μg/ml;PI5-10μg/ml;7-AAD10-20μg/ml.由于PI染料同時也與RNA結(jié)合,所以應(yīng)將細胞先用RNA酶消化(50Kunitz單位的RNA酶,37℃下作用15min或室溫下30min)后,再進行PI染色。

3.結(jié)果觀察

典型的凋亡細胞形態(tài)學(xué)改變：細胞體積縮小及變形;核濃染及喪失亞形態(tài)結(jié)構(gòu)，可見核染色質(zhì)呈新月形，或核碎裂成大小不等的核碎片;在組織切片上可見巨噬細胞或鄰近的上皮細胞吞噬凋亡細胞或凋亡小體。
 TUNEL細胞凋亡試劑盒內(nèi)容及操作步驟

(二)凋亡細胞的電鏡觀察

采用電鏡的常規(guī)方法固定，包埋和制片�？捎猛干潆婄R或掃描電鏡進行觀察。透射電鏡下，凋亡細胞核染色質(zhì)濃縮，核膜消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，而細胞器如線粒體等形態(tài)仍保持良好，可見被膜結(jié)構(gòu)包繞的細胞器，即凋亡小體。掃描電鏡下，細胞表面結(jié)構(gòu)如偽足，微絨毛等消失，細胞膜呈現(xiàn)波浪狀起伏。